苏云金芽孢杆菌伴孢晶体纯化方法研究

1、10化学与生物工程Chemistry&Bioengineering苏云金芽孢杆菌伴孢晶体纯化方法研究蒋辰1,李红梅2,弓爱君1,邱丽娜1(1.北京科技大学,北京100083;2.中国计量科学研究院,北京100013)摘要:苏云金芽孢杆菌是目前世界上研究最多、产量最大、,具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、易生物降解及无残毒等优点。、液体双相分离法、等电点沉淀法、离子交换分离法、碱裂解法、关键词:苏云金芽孢杆菌;伴孢晶体;纯化中图分类号:TQ45315文献标识码:A-(2008)06-0010-03自20世纪60年代以来,的重视。acillusthuringiensis,Bt)是一种革

2、兰氏阳性芽孢杆菌,其菌体为短杆状,生鞭毛,单生或形成短链。当菌体的营养体生长到一定阶段后,在菌体的一端形成芽孢,另一端形成被称为伴孢晶体的近菱形的蛋白质晶体。菌体破裂后可释放出芽孢和伴孢晶体,其中的伴孢晶体(原毒素)对鳞翅目或双翅目等多种昆虫具有毒杀活性1。Bt由于具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、生物降解无残毒、所用原料简单等优点,在虫害防治中发挥着越来越重要的作用2,自20世纪60年代实现工业化生产以来,已成为世界上用途最广、商业开发最成功、产量最大的微生物杀虫剂,每年以20%的速度增长3,4。随着对Bt研究的深入,Bt的基因改造、毒理学研究、杀虫机理、对人类的安全性等方面的研究都对高

3、纯度的Bt伴孢晶体提出了极大的需求,因此,Bt伴孢晶体的分离纯化方法逐步得到了发展,如等密度梯度离心法、液体双相分离法、等电点沉淀法、离子交换分离法、碱裂解法、高速离心法和生物物理法等。作者在此对这些方法进行了综述。以上新鲜培养基斜面中。接种后30恒温培养48h。将菌苔从培养基上刮下来制成水悬液,用磁力搅拌器搅拌,由于孢子密度较小,大部分进入泡沫,而伴孢晶体处于水层,除去泡沫就使孢子和晶体得到初步分离。重复几次以尽量去除孢子。然后用超声波处理,使芽孢、晶体在水中均匀分散5,于10000g离心1020min,弃去上清液,为了消除晶体中内生蛋白酶对晶体的非特异降解,用1molL-1NaCl生理盐水

4、洗涤沉淀。Augus用1molL-1NaCl于37洗涤晶体,而Yamarnmoto等发现015molL-1NaCl消除蛋白酶的效果更好。最后将得到的沉淀用1molL-1NaCl+0101%TritonX21006或0101%TritonX2100的生理盐水5制成孢晶悬液,即伴孢晶体粗品,其中含有细胞碎片、残留不溶性培养基及芽孢。2等密度梯度离心法制备伴孢晶体纯品等密度梯度离心法是利用密度的差异将伴孢晶体与杂质分离,从而获得纯品。该方法的特点是获得的伴孢晶体纯度较高,但产量较低、试剂及实验条件要求比较严格。其常用的密度试剂有蔗糖7、人工聚合蔗糖(Ficoll)、碱金属盐(CsCl、NaBr)、碘

5、化密度梯度介质(Renografin、Metrizamide、泛影葡胺)5等,硅溶胶(Ludox)密度梯度离心纯化晶体的方法也有报道8。其中蔗糖密度梯度离心方法简单,成本较低,但蔗糖溶解在水中的密度为113,分离孢晶混合物(平均密度为1131)时并不理想。人工聚合蔗糖(Ficoll)密度为1伴孢晶体粗品的制备取新鲜固体斜面培养基(牛肉膏3g,蛋白胨10g,氯化钠5g,琼脂1520g,水1000mL,pH值714716),分别做好标记,用无菌操作方法将待接菌种接入基金项目:国家标准物质资源共享平台建设项目(2005DKA21501),北京市教委产学研项目收稿日期:2008-02-20作者简介:蒋

6、辰(1988-),男,北京人,硕士研究生,研究方向:Bt生物农药伴孢晶体的纯化方法;通讯联系人:弓爱君,教授。E2蒋辰等:苏云金芽孢杆菌伴孢晶体纯化方法研究/2008年第6期111123,使用时也同样受到了限制9。碘化密度梯度介液,得到伴孢晶体13。质渗透压低,不易破坏分离物。溴化钠作为一种理想的梯度介质得到了广泛的应用,其价廉、粘度低,且有足够大的密度。利用11301134的溴化钠线性密度梯度离心分离晶体,可在浮力密度1132处得到晶体区。通过比较NaCl、CsCl、Renografin等不同介质的密度梯度离心可知,晶体在三者中的浮力密度并不相同,这是由于亲水程度不同或特异结合使不同类型密度

7、梯度中的浮力密度并不严格具有可比性,因此选择合适的梯度类型很重要。如果需要处理大量孢晶悬液时,可用空心转筒代替离心管进行区帯梯度离心10。溴化钠密度梯度离心纯化实验步骤:同的溴化钠溶液(218molL-11-1molL-1);黑色的杂质;,溶液;重复上述步骤;的溶液于47000rmin-1离心,收集晶体沉淀并用蒸馏水洗涤23次,配成晶体水溶液;置于冰箱中冷冻过夜后,放入冷却干燥机中24h除去冰溶液中的水,即得到白色的伴孢晶体。4等电点沉淀法制备伴孢晶体纯品氨基酸可以3种形式存在,即带正电荷、带负电荷和两性离子,如在酸性溶液中带正电荷、在碱性溶液中则带负电荷。若在某一pH值下氨基酸净电荷为零,且

8、在电场中不移动时,此pH值为它的PI值(等电点)。因为净电荷为零,净电斥力不存在,大部分蛋白质于等电点的pH值下,。等电点,该方法操作、14500rmin-1、4离心304molL-1乙酸钠-乙酸溶液(pH值410)调pH值达到510左右,4下沉淀4h后于12000rmin-1、4离心30min,沉淀物用无菌水洗涤数次后溶于pH值916的20mmolL-1Tris缓冲溶液中,置-20保存。5离子交换分离法制备伴孢晶体纯品离子交换分离法是利用离子交换树脂上的可交换离子发生的变换反应达到分离和提纯的目的14。离子交换反应是可逆平衡反应(以阳离子交换反应为例):R-H+M+R-M+H+。为使反应不断

9、地朝生成物的方向进行,需采取不断分离产物的操作,因此常借助离子交换柱进行动态离子交换以实现这一目的。酶和蛋白质都有电解质性质,故可用离子交换法进行分离提纯。韩岚岚等15通过HiTrapQ柱层析分离纯化BtCry毒素及原毒素蛋白;Bietlot等16用40%(质量体积比)的硫酸铵沉淀,再对缓冲溶液透析后分离纯化毒素蛋白。该方法具有设备简单、操作方便、分离速率快且效率高的优点,广泛应用于化工、医药、食品、造纸和冶金等领域。实验步骤:取孢晶悬液于缓冲溶液BufferA1(20mmolL-1Ethanolamine,pH值917)中4透析过夜,然后离心(4,12000rmin-1,10min),取上清

10、液。对BufferA1、BufferA2(20mmolL-1Etha2nolamine,1molL-1NaCl,pH值917)各1000mL3液体双相分离法制备伴孢晶体纯品液体双相分离法利用互不相溶的两种液体对晶体和芽孢的亲和性不同(即晶体、芽孢表面特性不同)而达到分离目的。该方法产量较高、所用试剂廉价、仪器简单,但纯度不高、试剂毒性比较大、操作不方便。其常用的有三种液体双相体系,一种是聚合物-聚合物双相体系11,如聚乙二醇(PEG)-葡萄糖-水、聚乙二醇-硫酸葡聚糖钠和聚丙烯酰胺-葡聚糖钠;另一种是聚合物-盐体系,如聚乙二醇-磷酸盐-水;还有一种是盐水与有机溶剂组成的液体双相体系,如三氟三氯

11、乙烷-硫酸钠、氯仿-水、四氯化碳-硫酸钠等体系12。据报道,在聚乙二醇-磷酸盐-水体系中,影响纯化效果的因素有:PEG的分子量及浓度、磷酸二氢钠与磷酸氢钠的比例、进样量和离心速度。其中,PEG影响着蛋白质分子在两相中的分配;磷酸二氢钠与磷酸氢钠的比值较低,更有利于晶体分配到下相。盐水与有机溶剂双相体系纯化实验步骤:取0107gmL-1孢晶悬液,磁力搅拌使之产生泡沫,除去泡沫后,倒入分液漏斗,加入1%硫酸钠、四氯化碳(体积比为767),振荡10min后再静置15min,使晶体进)40min,弃去上清入水相,将水相离心(28000g,4分别进行抽滤、超声波脱气处理,先用BufferA1平衡FPLC

12、(Fastproteinliquidchromatography)的MonoQ(1mL)离子交换柱,以1mLmin-1的流速将上清液过柱,用0%100%盐线性梯度洗脱,根据计算机读取的280nm紫外吸收峰,从开始出现的第一个蛋白吸收峰开始接收洗脱液1。12蒋辰等:苏云金芽孢杆菌伴孢晶体纯化方法研究/2008年第6期6碱裂解法制备伴孢晶体纯品苏云金芽孢杆菌产生的伴孢晶体是一种碱溶性蛋白,由cry基因和cyt基因所编码。在pH值高于915时,大多数的cry毒素和cyt毒素溶解,少数需要在pH值为12时才完全溶解。因此选用pH值916的碳酸钠缓冲溶液才能保证大多数的蛋白质从菌体中溶出。碱裂解法基于上

13、述原理制备伴孢晶体纯品。实验步骤:将孢晶悬液于4500rmin-1、4离心20min,沉淀用含011%TritonX2100的生理盐水洗虫毒力。作者认为,多种方法联用、开发新方法将成为Bt伴孢晶体纯化的发展方向。参考文献:1宋平,潘映红,陆秀君,等.两种纯化苏云金芽孢杆菌HD273毒素蛋白方法的比较研究J.河北农业大学学报,2005,28(3):63265.2姚伟芳,弓爱君,邱丽娜,等.苏云金芽孢杆菌固态发酵条件的优化J.化学与生物工程,2006,23(11):42244.3朱仕房,杨曜中.双水相体系分离苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的研究J.世界农药,2000,22(5):39242.4喻子牛,柯云

14、,刘子铎,等.涤,4500rmin-1、4离心后用无菌水洗涤3次,于4500rmin-1、4离心20min,取沉淀溶于50mmolL-1碳酸钠缓冲溶液(含1%22,pH916),摇匀后于4放置2h。:,2000:11220.5,温洁.J.微3)2288.6D,FastPG.Bacillusthuringiensis2endotoxin:AnimprovedtechniquefortheseparationofcrystalsfromsporesJ.JournalofInvertebratePathology,1977,29(2):2302231.7ThomasWE,EllarDJ.Bacill

15、usthuringiensisvarisraelensiscrystal7或密度的不同而进行分离提纯的。该方法对固体颗粒很小、液体粘度很大及难于过滤的悬浮液十分有效,对那些忌用助滤剂或助滤剂使用无效的悬浮液的分离,也能得到满意的结果17。同时该方法制备时间缩短、所用试剂廉价,得到的伴孢晶体纯度可达99%以上,是大规模生产中应用最广泛的方法18。实验步骤:将孢晶悬液于18000rmin-1、4离心30min,除去菌体和其它不溶性碎片,取上清液得Bt蛋白溶液,置-20保存19。2endotoxinJ.JCellSci,1983,60:1812197.8YuShengZhu,AllanBrookes

16、,KenCarlson,etal.SeparationofproteincrystalsfromsporesofBacillusthuringiensisbyludoxgradientcentrifugationJ.ApplEnvironMicrobiol,1989,55(5):127921281.9陈涛.生物农药检测及其原理M.北京:农业出版社,1993:1642330.10AngBJ,NickersonKW.PurificationoftheproteincrystalfromBacillusthuringiensisbyzonalgradientcentrifugationJ.Ap2pl

17、iedandEnvironmentalMicrobiology,1978,36(4):6252626.11李萍,刘丰茂.苏云金芽孢杆菌(Bt)晶体毒素的分离与纯化J.农药,1996,35(12):13216.12GuerecaL,BravoA,QuinteroR.Designofanaqueoustwo2phasesystemforthepurificationofICPfromBacillusthuringiensisJ.ProcessBiochemistry,1994,29(3):1812185.13张敏鹰,范秀华,邢建民,等.苏云金杆菌芽孢与晶体不同配比对8生物物理法制备伴孢晶体纯品生物

18、物理法是利用抗生素破坏芽孢萌发后的营养体,然后离心分离,或利用无芽孢或寡芽孢突变株获得纯净伴孢晶体11。该方法所用试剂昂贵、实验条件苛刻、产率低。亚洲玉米螟的毒效J.生物防病通报,1988,4(4):1612164.14ClairmontFR,MilneRE,PhamVT.RoleofDNAintheacti2vationoftheCry1AinsecticidalcrystalproteinfromBacillusthuringiensisJ.TheJournalofBiochemistry,1998,273(15):929229296.15韩岚岚,宋福平,李长友,等.苏云金芽孢杆菌cry基

19、因在大肠杆9结语不同伴孢晶体纯化方法各有优缺点。等密度梯度离心法提取蛋白量少,而且超离心时间很长,约14h,一般实验室无此条件且成本高,不宜大量提取。碱裂解法在提取过程中需要保持低温状态,以免伴孢晶体被自身产生的碱性蛋白水解酶降解。液体双相分离法能保持伴孢晶体天然的完整结构,真实地反映出蛋白质特有的形态结构与毒力一致性,但纯度不高。等电点沉淀法提取伴孢晶体的量是液体双相分离法的2倍,但等电点沉淀法破坏了伴孢晶体的形态,影响了杀菌中表达产物和生物活性J.植物保护,2002,28(5):529.16BietlotH,CareyPR,ChomaC,etal.Facilepreparationandc

20、haracterizationofthetoxinfromBacillusthuringiensisvar.kurstakiJ.BiochemistryJ,1989,260(1):87291.17弓爱君,孙翠霞,邱丽娜.Bt生物农药M.北京:化学工业出版社,2006:1062107.18周学永,金红,杨志生,等.苏云金芽孢杆菌发酵液后处理工艺研究进展J.化学与生物工程,2006,23(1):426.19郭艾英,王硕.苏云金芽孢杆菌晶体蛋白的制备方法J.食品与发酵工业,2005,31(8):8210.(下转第20页)20王艳萍等:二茂铁桥联聚倍半硅氧烷修饰电极的制备及循环伏安表征/2008年第6

21、期hybridorganic2inorganicmaterialsJ.ChemRev,1995,95(5):143121442.4刘丰祎,符连社,王俊,等.桥联聚倍半硅氧烷的近期研究进性,峰电流稍有下降。这说明BESF膜在有机溶剂中具有良好的稳定性,这是物理吸附法无法达到的。3结论以合成的二茂铁桥联聚倍半硅氧烷单体化合物BESF与TEOS为前驱物,采用溶胶-凝胶法制备了二茂铁桥联聚倍半硅氧烷膜修饰玻碳电极。循环伏安表征结果表明,该膜电极具有良好的循环伏安行为;二茂铁氧化还原电对在电极上的反应同时受扩散和电子转移速率的控制;多次的连续扫描和有机溶剂循环清洗实验证明该膜具有良好的稳定性。参考文献:

22、1WightAP,DavisME.Designandpreparationoforganic2ichybridcatalystsJ.ChemRev,2002,102)23614.2BaoXY,LiX,ZhaoXS.ofmetbridgedperiodicit.JPhyChemB,2006(62展单体合成及应用J.化学通报,2003,66(6):3822403.5HattonB,LandskronK,WhitnallW,etal.Past,present,andfu2tureofperiodicmesoporousorganosilicasthePMOsJ.AccChemRes,2005,38(

23、4):3052312.6GerveauC,CorriuRJP,FrameryE.Nanostructuredorganic2inor2ganichybridmaterials:KineticcontrolofthetextureJ.ChemMater,2001,13(10):337327,.1二22(三乙氧基硅基)乙基二茂C.:,2006:8.M.北京:北京师范大学出版社,1995:222.,干宁,葛从辛.辅酶Q在CPT自组装修饰电极上的电化学行为及其分析应用J.理化检验-化学分册,2006,42(8):6042607.PreparationandCyclicVoltammetryCharac

24、terizationofFerroceneBridgedPolysilsesquioxanesModifiedElectrodeWANGYan2ping,ZHANGTie2ming,GAOChun2guang,ZHAOYong2xiang(EngineeringResearchCenterofFineChemicalsofMinistryofEducation,SchoolofChemistryandChemicalEngineering,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China)Abstract:Anovelferrocenebridgedalkoxysilanewasadoptedtoprepareamodifiedglassycarbonelectrodeviaasol2gelprocess.Themodifiedelectrodewascharacterizedbycyclicvoltammetryin011molL-1tetrabu2tylammoniumfluoroborate(TBAFB)acetonitrilesolutionandshowedapropertyofquasi2reversibleredox.Thefil