生物技术概论

1、生生 物物 技技 术术 概概 论论东北农业大学生命科学学院东北农业大学生命科学学院 李李 杰杰绪绪 论论一、生物技术的定义 生物技术(biotechnology),也称生物工程(bioengineering)，是指人们以现代生命科学为基础，接合先进的工程技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品。 生物技术是有多学科综合而成的一门新学科。二、生物技术的种类及其相互关系二、生物技术的种类及其相互关系生物技术主要包括以下生物技术主要包括以下5项技术：项技术：1.基因工程（gene engineering）2.细胞工程（cell engineering）3.酶工程（enz

2、yme engineering）4.发酵工程（fermentation engineering）5.蛋白质工程（protein engineering ）1.基因工程（基因工程（gene engineering） 基因工程是70年代兴起的一门新技术，其主要原理是应用人工方法把生物的遗传物质，通常是DNA分离出来，在体外进行切割、拼接和重组。然后将重组了的DNA导入某种宿主细胞或个体，从而改变它们的遗传品性；有时还使新的遗传信息在新的宿主细胞或个体中大量表达，以获得基因产物。也称DNA重组技术。2.细胞工程（细胞工程（cell engineering） 所谓细胞工程是指以细胞为基本单位，在体外条

3、件下进行培养、反之，或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种，加速繁育动、植物个体，或获得某种有用物质的过程。包括动、植物细胞的体外培养技术、细胞融合技术、细胞器移植技术等。3.酶工程（酶工程（enzyme engineering 所谓酶工程是利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能，或对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的一项技术。包括酶的固定化技术、细胞的固定化技术、酶的修饰改造技术及酶反应器的设计等技术。 4.发酵工程发酵工程（fermentation engineering） 利用微生物生长速度快、生长条件简单以及代谢

4、过程特殊等优点，在合适条件下，通过现代工程技术手段，由微生物的某种特定功能生产出人类所需的产品称为发酵工程，也称微生物工程。 5.蛋白质工程（蛋白质工程（protein engineering ） 是指在基因工程的基础上，接合蛋白质结晶学、计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对基因的人工定向改造，从而达到对蛋白质进行修饰、改造、拼接以产生能满足人类需要的新型蛋白质。这这5项技术是互相联系、互相渗透的项技术是互相联系、互相渗透的三、生物技术涉及的学科三、生物技术涉及的学科 现代生物技术是所有自然科学领域中涵盖范围最广的学科之一。它包括分子生物学、细胞生物学、微生物学、免疫生物学、人

5、体生理学、动物生理学、植物生理学、微生物生理学、生物化学、生物物理学、遗传学等几乎生物科学所有的次级学科，又结合了化学、化学工程学、数学、微电子技术、计算机科学等尖端基础学科，是一门多学科互相渗透的综合性学科。四、生物技术对经济社会发展的影响四、生物技术对经济社会发展的影响1.改善农业生产，解决食品短缺。改善农业生产，解决食品短缺。1.1提高农作物产量及品质提高农作物产量及品质（1）培育抗逆的作物优良品系；（2）植物种苗的工厂化生产；（3）提高粮食品质；（4）生物固氮，减少化肥用量。1.2发展畜牧业生产发展畜牧业生产（1）动物的大量快速无性繁殖；（2）培育动物的优良品系。转基因技术与转基因生物

6、转基因技术与转基因生物 通过基因工程技术对生物进行基因转移，使生物体获得新的优良品性，称之为转基因技术。通过转基因技术获得的生物体称之为转基因生物。四、生物技术对经济社会发展的影响四、生物技术对经济社会发展的影响2.提高生命质量，延长人类寿命提高生命质量，延长人类寿命 （1）开发新型药品 （2）疾病的预防和诊断 （3）基因治疗 （4）人类基因组计划（HGP） 3.解决能源危机，治理环境污染解决能源危机，治理环境污染 （1）解决能源危机 （2）环境保护 4.制造工业原料，生产贵重金属制造工业原料，生产贵重金属 （1）制造工业原料 （2）生产贵重金属五、发展生物技术的重要性五、发展生物技术的重要性

7、1.生物技术是解决全球性经济问题的关键技术。2.生物技术促进传统产业的技术改造和新兴产业的形成，对人类社会生活将产生深远的革命性的影响。 生物技术将是生物技术将是2121世纪高新技术革命的核心世纪高新技术革命的核心内容，生物技术产业将是内容，生物技术产业将是2121世纪的支柱产业。世纪的支柱产业。第二章第二章 基因工程基因工程l基因工程的基本含义 ： l 按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物特性，使现有物种在较短的时间内趋于完善，创造新的生物类型。第一节第一节 基因工程工具酶和基因工程工具酶和DNA加工加工 一般把DNA分子切割、 DNA片段末端修饰

8、和DNA片段连接等所用的酶称为工具酶。一、限制性内切酶一、限制性内切酶 限制性内切酶（restriction endonuclease）是一类一环状或线形DNA为底物，能识别DNA种特定核苷酸序列，并在合适反应条件下断开磷酸二酯键，产生具有3?1OH和5 ?1P基团DNA片段的内脱氧核苷酸酶。目前基因工程中所用的是II型酶。1.限制性内切酶在限制性内切酶在DNA分子上的识别顺序分子上的识别顺序 限制性内切酶在双链DNA分子上能识别的特定核苷酸序列称之为识别序列，也称识别位点。识别序列多数由4、5、6个核苷酸组成，其共同特点是呈现碱基互补对称。2.限制性内切酶切割限制性内切酶切割DNA的位点和切

9、割片段的末端的位点和切割片段的末端 II型限制性内切酶的切割位点位于识别序列区内，不同的酶切割DNA分子后所产生的末端不同。 有些限制性内切酶虽然识别序列不同，但切割DNA分子产生的DNA片段具有相同的末端，称之为同尾酶。二、二、DNA连接酶连接酶 能催化两个DNA片段末端之间-P和-OH基团形成磷酸二酯键，是两个末端连接的酶称为DNA连接酶（DNA ligase）.现用的DNA连接酶有两种：（1）E.coli DNA 连接酶；（2）T4 DNA连接酶三、三、DNA片段末端修饰酶片段末端修饰酶1.末端脱氧核苷酸转移酶2.核酸外切酶3.碱性磷酸酶第二节第二节 基因克隆载体基因克隆载体 一般而言，

10、外源基因必须先同某种传递者结合后才能进入细菌和动植物受体细胞，把这种能承载外源DNA片段(基因)带入受体细胞的传递者称之基因克隆载体(gene cloning vector)。 作为基因克隆载体至少必须具备3个条件：(1)具有能使外源DNA片段组人的克隆位点。(2)能携带外源DNA进入受体细胞，或游离在细胞质中进行自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而复制。(3)必须具有选择标记，承载外源DNA的载体进入受体细胞后，以便筛选克隆子。一、质粒载体一、质粒载体 质粒载体是最早发展起来的一类基因克隆载体，以质粒DNA为基础构建而成，是微生物和植物转基因研究的主要载体。 质粒是细胞中染

11、色体外的裸露DNA分子，广泛存在于细菌之中，在某些蓝藻、绿藻和真菌细胞中也存在质粒。一个质粒就是一个DNA分子，多数以超螺旋环状共价双链分子形式存在，以ccDNA表示，体外在理化因子作用下可成为开环 或线形分子。构建质粒载体一般选用分子小和松弛型复制的质粒。至今已构建了不下几百种的质粒载体，现举例如下：1.pBR3222.pUC18/19二、噬菌体和病毒载体二、噬菌体和病毒载体1. cosmid载体 由带cos位点的 DNA片段与质粒构建的载体称之为cosmid载体。2.CaMV基因克隆载体（1）互补载体系统（2）混合载体系统（3）CaMV35S启动子融合基因载体系统第三节第三节 目的基因导入

12、受体细胞目的基因导入受体细胞一、 受体细胞 所谓基因克隆的受体细胞，从实验技术上讲是能摄取外源 nNA(基因)并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用 价值和理论研究价值的细胞。原核生物细胞、植物细胞和动物细胞可以作为受体细胞。1.原核生物细胞原核生物细胞 原核生物细胞是一类很好的受体细胞，容易摄取外界的DNA，增殖快，基因组简单，便于培养和基因操作，普遍被用作cDNA文库和基因组文库的受体菌，或者用来建立生产目的基因产物的工程菌，或者作为克隆载体的宿主。目前用作基因克隆受体的原核生物主要是大肠杆菌，蓝藻和农杆菌等也被广泛应用。2.真核生物细胞真核生物细胞 真核生物细胞作为基因克隆受体近来

13、已受到很大的重视。1.酵母酵母：由于某些性状类似原核生物，所以较早就被用作基因克隆受体。2.动物细胞动物细胞：也已被用作受体细胞，但由于体细胞不易再分化成个体，所以采用生殖细胞、受精卵细胞或胚细胞作为基因转移的受体细胞，由此培养成转基因动物。不过最近通过体细胞培养出了多种克隆动物，由此可见动物体细胞同样可以用作基因克隆的受体细胞。3.植物细胞植物细胞：作为基因克隆的受体细胞，有其优于动物细胞的特点，一个活的离体体细胞在合适的培养条件下比较容易再分化成植株，意味着一个获得外源基因的体细胞可以培养成能传代的植株，成为转基因植物。由于这个原因，近年来植物基因工程发展非常迅速。二、目的基因组入克隆载体

14、二、目的基因组入克隆载体 目的基因导入受体细胞之前，一般须先把含目的基因的DNA片段组入合适的克隆载体。为选用合适的克隆载体，必须注意以下几点：为了使组入的目的基因能够在受体细胞中有效表达，应选用具强启动子的表达载体。根据确定的受体系统，选用相应的克隆载体，因为用作受体细胞的不同生物类型有各自适用的克隆载体。选用的克隆载体应是便于同含目的基因的DNA片段进行连接。 根据实验设计，有了合适的克隆载体和含目的基因的DNA片段，则选用限制性内切酶切割，并用DNA连接酶连接，得到预期的重组DNA分子。三、重组三、重组DNA分子导入原核生物细胞分子导入原核生物细胞 可以通过转化、转导和三亲本杂交等途径，

15、 把重组DNA分子导入原核生物细胞。1.转转 化化 携带基因的外源DNA分子通过与膜结合进人受体细胞，并在其中稳定维持和表达的过程称为转化(transformation)。DNA转化大肠杆菌的技术路线包括制备感受态细胞和转化处理。 感受态细胞指处于能摄取外界DNA分子的生理状态的细胞。2.转转 导导 通过噬菌体(病毒) 颗粒感染，把DNA导入被感染的受体细胞的过程称为转导(transduction)。含目的基因的DNA与噬菌体(病毒)载体的重组DNA分子导人受体细胞，一般先须进行体外包装。为此，根据噬菌体体内包装的原理，获得了分别缺D蛋白和E蛋白入噬菌体突变株的两种溶源菌。这两种溶源重菌单独培

16、养，因各缺一种包装必备的蛋白质，所以体内即使有 DNA也不能进行包装，因此细胞内积累了大量除一种以外的其他供包装用的蛋白质。如果在试管内混合两种溶源菌合成的蛋白质，D蛋白和E蛋白互相补充，就可以包装 DNA或重组的 DNA。3.重组重组重组重组DNA分子通过三亲本杂交转分子通过三亲本杂交转化大肠杆菌化大肠杆菌 当重组DNA分子不能直接转化受体菌时，可采用三亲本杂交(triparental mating)转化法。被转化的受体菌、含重组DNA分子的供体菌和含广泛宿主辅助质粒的辅助菌三者进行共培养，在辅助质粒的作用下，重组DNA分子被转移到受体茵细胞内，按照重组DNA分子携带的选择标记筛选克隆子。

17、四、重组四、重组DNA分子导入真核生物细胞分子导入真核生物细胞 由于真核生物的细胞结构较为复杂，适用于原核生物基因转移的方法不能有效地用于真核生物。近年来经过探索，发展了多种适用于植物和动物转基因的方法。1. 重组重组DNA分子导入植物细胞分子导入植物细胞（1）用根癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 含有Ti质粒的根癌农杆菌与一些植物的细胞接触后，Ti质粒的一部分 (T- DNA)可以导人植物细胞，整合到植物基因组中，随其复制而复制。根据这一特性可构建一系列Ti质粒载体，与含目的基因的DNA片段重组，导入根癌农杆菌，再采用叶盘转化法、原生质体共培养法和悬浮细胞共培养法，通过根癌农杆菌介导进入植物

18、细胞。 用根癌农杆菌介导法已获得了一些转基因植物，但是一般局限于双子叶植物。1. 重组重组DNA分子导入植物细胞分子导入植物细胞(2)重组DNA的直接转移法 为克服致癌农杆菌介导法的受体局限性，近来发展了电穿孔法、微弹轰击法、激光微束穿孔法、多聚物介导法和花粉管通道法等，把重组DNA分子直接导入植物细胞。微弹轰击法：微弹轰击法： 金属微粒在外力作用下达到一定速度后，可以进入植物细胞，但又不引起细胞致命伤害，仍能维持正常的生命活动。利用这一特性，先将含目的基因的外源DNA同钨、金等金属微粒混匀，使DNA吸附在金属微粒表面，随后用基因枪轰击，使DNA随高速金属微粒进入植物细胞。此方法可直接处理植物

19、某器官或某组织，是当今普遍使用的植物转基因方法。电穿孔法电穿孔法 细胞膜的基本组成是磷脂，在适当的外加脉冲电场作用下，细胞膜被击穿，但还达不到细胞致命伤害。所以当移去外加电场后，被击穿的膜孔可自行复原。根据这一性质，植物原生质体同外源DNA分子混合，置于电击仪的样品室中，按预定的参数进行直流电脉冲处理，再通过常规的再分化培养和筛选，可获得转基因植株。为避免制备原生质体和原生质体再生植株的困难，近来用此技术享接处理具有完整细胞壁的植物细胞、愈伤组织和花粉粒，均取得一定的效果。激光微束穿孔法激光微束穿孔法 利用直径很小、能量很高的激光微束可引起细胞膜可逆性穿孔的原理，在荧光显微镜下用激光处理细胞，

20、处于细胞周围的重组DNA随之进入细胞。此方法最适用于活细胞中线粒体和叶绿体等细胞器的基因转移。多聚物介导法多聚物介导法 聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸和多聚鸟氨酸等是协助DNA转移的常用多聚物，尤以PEG应用最广。这些多聚物同二价阳离子和DNA混合，可在原生质体表面形成颗粒沉淀，使DNA进入细胞内。花粉管通道法花粉管通道法 将重组DNA涂于授粉的柱头上，使DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化尚不具有正常细胞壁的卵、合子和早期的胚胎细胞，在活体内产生转基因种子。 此外还有人使用显微注射法和脂质体介导法进行转化。2.重组重组DNA分子导入哺乳动物细胞分子导入哺乳动物细胞 哺乳动物的细

21、胞不易从周围捕获外源DNA ，明显地影响了哺乳动物转基因的发展。近年来通过研究发展了一系列能有效地将外源DNA分子导入哺乳动物细胞的方法，主要有以下几种。(1)病毒颗粒转导法病毒颗粒转导法 由于病毒的种类繁多，用病毒DNA或RNA构建的载体性质各异，所以转导的过程各有不同，主要有三种类型：其一，带有目的基因的病毒颗粒直接感染受体细胞，目的基因随同病毒DNA分子整合到受体细胞染色体DNA上；其二，带有目的基因的病毒基因组是缺陷型的，需同另一辅助病毒一起感染受体细胞；其三，虽然带有目的基因的病毒基因：组是缺陷型的，但是被感染的受体细胞的基因组中已整合了病毒缺失的基因，所以没有必要用辅助病毒混合感染

22、。(2)磷酸钙转染法磷酸钙转染法 哺乳动物细胞能捕获粘附在细胞表面的DNA磷酸钙沉淀物，使DNA转入细胞。先将待转染的重组DNA同CaCl2混合制成CaCl2 -DNA溶液，随后逐渐缓慢地加入Hepers磷酸钙溶液中，形成DNA-磷酸钙沉淀，粘附在培养的细胞表面上，达到转染目的。(3)DEAE葡聚糖转染法葡聚糖转染法 DEAEdextran(二乙胺乙基葡聚糖)是一种高分子量的多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源DNA分子。基本操作过程主要有两种方式：其一，先使病毒的DNA直接同DEAE葡聚糖混合，形成DNADEAE葡聚糖复合物,再处理受体细胞；其二，受体细胞先用DEAE葡聚糖溶液预处理，

23、随后再同DNA接触，也可达到转染目的。(4)聚阳离子聚阳离子DMSO(二甲基亚砜二甲基亚砜)处理转染法处理转染法 用聚阳离子(叫ybrene)处理哺乳动物细胞，使细胞表面增加对外源DNA的吸附能力，再用25-30 DMSO处理细胞，增加膜的通透性，提高对DNA的捕获量，达到有效的转染。(5)脂质体介导法脂质体介导法 脂质体是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构，把用来转染的DNA分子包在其中，通过脂质体与细胞接触，将外源DNA导人受体细胞。包装成脂质体的DNA的转染串比裸露的DNA的转染率高出100倍。如先用PEG处理培养的受体细胞，使其易吸收培养基中的脂质体，可提高转染率1020倍。在正常

24、情况下，每个细胞平均可吸收1000个左右的脂质体。这是哺乳动物转基因研究中常用的方法之一。(6)显微注射转基因技术显微注射转基因技术 鉴于哺乳动物细胞便于注射的特性，常应用显微注射法把外源DNA分子直接注人细胞。 此外，为便于操作，也可采用“穿刺”法。处于细胞周围的DNA随微针穿刺形成的小孔进入细胞，或随穿刺的针头带入细胞。 (7)电穿孔法电穿孔法 其原理和操作过程类似植物细胞的电穿孔 转移DNA的方法。第四节、克隆子的筛选和签定第四节、克隆子的筛选和签定 受体细胞经转化(转染)或转导处理后，真正导入目的基因并能有效表达的克隆子一般来说只是一小部分，而绝大部分仍是原来的受体细胞。为了从处理后的

25、大量受体细胞中分离出真正的克隆子，已建立了一系列筛选和鉴定的方法，主要有以下几种。一、利用克隆载体携带的选择标记基因一、利用克隆载体携带的选择标记基因筛选克隆子筛选克隆子 1.抗菌素抗性基因 2.lacZ基因 1. 利用抗菌素抗性基因进行筛选利用抗菌素抗性基因进行筛选 不同克隆载体通常分别携带不同的抗性基因，如Ampr(抗氨苄青霉素)、Cmpr (抗氯霉素)、Kan r(抗卡那霉素)、Tetr (抗四环素)和Strr (抗链霉素)等。当含任何一种抗菌素抗性基因的载体处理不具这种抗性基因的受体细胞，并在含相应抗菌素的培养基上培养时，只有获得载体的受体细胞才能继续生长，这样便可筛选出含克隆载体的克

26、隆子。 要筛选含目的基因的克隆子，可选用具Ampr和Tetr这样的双抗选择标记载体，把含目的基因的DNA片段插入其中之一的Tetr选择标记基因区，导致该基因的插入失活。用这样的重组DNA处理不抗Amp和Tet的受体细胞，先在只含Amp的培养基上培养。结果是含重组DNA或只含克隆载体的受体细胞均能长成菌落(藻落或细胞团)。随后从每个菌落取一部分再接种在含Tet的培养基上培养，能继续生长的是被克隆载体转化的克隆子，而含目的基因的重组DNA转化的受体细胞不能生长。据此可以从原来仍保留的系列菌落中筛选出含目的基因的真正克隆子。2. 利用乳糖操纵子利用乳糖操纵子1ac Z基因筛选克隆子基因筛选克隆子 具

27、完整乳糖操纵子的菌体能翻译 -半乳糖苦酶(Z)、透性酶(Y)和乙酰基转移酶(A)，当培养基中含有X-gal(5-溴4-氯-3-吲哚- -D-半乳糖苷)和IPTG(异丙基硫代- -D半乳糖苷) 时，可产生蓝色沉淀，使菌落成蓝色。如含乳糖操纵子缺陷型 (lac Z )的载体转化互补型菌株，在含X-gal和IPTG的培养基中培养，克隆子是蓝色菌落，而未转化的互补型菌株的菌落是白色的。当含目的基因的DNA片段插入lac Z基因区，即使转化互补型菌株细胞，在含X-gal和IPTG的培养基中，也是长出白色的菌落。由此可以根据茵落的蓝、白颜色筛选出含目的基因的克隆子。为区分含目的基因的克隆子与未被转化的受体

28、菌(白色菌落)，可在选择培养基中添加克隆载体其他选择标记药物。三、利用双酶切片段重组法初筛克隆子三、利用双酶切片段重组法初筛克隆子 在无法利用克隆载体选择标记的情况下，可以考虑采用双酶切片段重组法。根据实验设计，选用两种限制性内切酶切割载体DNA分子，用凝胶电泳回收两端具不同粘性末端的线形载体DNA，并经碱性磷酸酶处理后，与同样用那两种限制性内切酶切割获得的含目的基因的DNA片段连接，转化受体细胞，在含克隆载体选择标记药物的培养基上培养，长出的菌落绝大部分是含目的基因的克隆子。因为如此处理的克隆载体DNA不能自行环化，只有同具有相同粘性末端的含目的基因的DNA片段连接成环状DNA分子，才能有效

29、地转化受体细胞。但不排除有少量线形的克隆载体DNA转化的受体细胞，长出只含载体的克隆子。四、利用报告基因筛选克陷子四、利用报告基因筛选克陷子 对于那些不宜用克隆载体选择标记筛选克隆子的受体细胞，往往在含目的基因的DNA片段与克隆载体连接之前，先在目的基因上游或下游连接一个报告基因。这样的重组DNA导人受体细胞后，可根据报告基因的表达产物筛选克隆子。常用的报告基因有GUS(葡萄糖苷酸酶)基因和LUC(荧光素酶)基因，利用这些基因产物催化特定底物的反应产物筛选出克隆子。此外，NPT- (新霉素磷酸转移酶 )基因和CAT(氯霉素乙酰基转移酶)基因也可用作报告基因。五、克隆子的进一步鉴定五、克隆子的进

30、一步鉴定 用上述方法筛选的克隆子，难免得到一些假的克隆子。为进一步鉴定克隆子的真假，可采用限制性内切酶分析、分子杂交、PCR扩增DNA测序等方法。1、限制性内切酶分析法、限制性内切酶分析法 这是一种最简单也是最常用的方法，从克隆子提取DNA，经凝胶电泳检测，若出现外DNA带，可初步认定是克隆子；在此基础上，回收外源DNA，根据实验设计选用一些限制性内切酶切割，进一步用凝胶电泳检测，如果检测结果同原来用于转化的外源DNA被这些酶切割的结果一致，则可认为是真的克隆子。2、分子杂交法、分子杂交法 根据实验设计，先制备含目的基因的DNA片段的探针，随后采用斑点杂交或DNA印迹(southern blo

31、tting)等方法进行鉴定。(1)斑点杂交法斑点杂交法 (2)southern杂交法杂交法3、 PCR法法 根据含目的基因两端或两侧已知核昔酸序列，设计合成一对引物，以待鉴定的克隆子的DNA为模板进行扩增，若获得特异性扩增DNA片段，表明待鉴定的克隆子含有目的基因，是真的克隆子。此方法的优点是灵敏、快速，并且可证实是完整的目的基因。而采用DNA分子杂交的方法，只要在被杂交的DNA中存在目的基因的一部分DNA序列，就会出现杂交信号。4、 DNA测序法测序法 以上方法可断定克隆子含有目的基因，但并不能了解目的基因的核苷酸序列在一系列操作过程中是否发生了变化。为此还必须进行目的基因的核苷酸测序。如果待测序的目的基因比较大，测序有困难，也可用RFLP(限制性片段长度多态性)技术。用限制性内切酶对待克隆的目的基因和已克隆的目的基因进行切割，若凝胶电泳结果不一致，可断定克隆子中克隆的不是目的基因，或者克隆的目的基因的核苷酸序列已发生了变化。经多种限制性内切酶切割分析，若两者结果都一样，可认为克隆子中克隆的是原定的目的基因，其核苷酸序列没有变化。5、目的基因转录产物检测、目的基因转录产物检测 通过克隆子筛选和鉴定，证实含目的基因的DNA片段已随克隆载体进入受体细胞，以不同方式进