多聚酶链式反应扩增DNA片段课件2014年3月

1、谁是凶手？谁是凶手？英国遗传学家英国遗传学家JefferysJefferys通过通过DNADNA分子生物学实验方法获得了一系列分子生物学实验方法获得了一系列可以在胶片上看到的图纹，这些图纹极少有两个人完全相同，与可以在胶片上看到的图纹，这些图纹极少有两个人完全相同，与人的指纹一样是每个人所特有的人的指纹一样是每个人所特有的. .故称为故称为“DNA“DNA指纹指纹”1 1、将毛发、血痕、精斑、人体组织或白骨等所含的、将毛发、血痕、精斑、人体组织或白骨等所含的DNADNA提取出来提取出来2 2、将、将DNADNA样品进行样品进行PCRPCR扩增扩增。3 3、选用与探针配对的限制性核酸内切酶，在长

2、链、选用与探针配对的限制性核酸内切酶，在长链DNADNA位置上加以位置上加以切割，将分子量很大的切割，将分子量很大的DNADNA长链切成许多长度不同的小片段长链切成许多长度不同的小片段 。4 4、在胶板尺寸较长的凝胶电泳仪中，对酶解完全后的在胶板尺寸较长的凝胶电泳仪中，对酶解完全后的DNADNA片段进行电片段进行电泳，各酶切片段就会按其长度大小在电场中进行分离。泳，各酶切片段就会按其长度大小在电场中进行分离。5 5、先用碱性溶液使凝胶板中分离开的双链、先用碱性溶液使凝胶板中分离开的双链DNADNA片段变性为单链片片段变性为单链片段，然后将凝胶板夹在尼龙膜中，并永久性地固定在尼龙膜上。段，然后将

3、凝胶板夹在尼龙膜中，并永久性地固定在尼龙膜上。6 6、让放射性、让放射性DNADNA探针与尼龙膜上的单链探针与尼龙膜上的单链DNADNA片段进行杂交。片段进行杂交。5.2 5.2 多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNADNA片段片段应用：应用： 的诊断、的诊断、 、 、 和和DNADNA 等各方面。等各方面。遗传疾病遗传疾病刑侦破案刑侦破案基因克隆基因克隆序列测定序列测定了解应用了解应用 理解原理理解原理放什么物质？创设什放什么物质？创设什么条件？为什么？么条件？为什么？古生物学古生物学 PCRPCR美国科学家美国科学家以极少数的以极少数的DNADNA为模板，在几小为模板，在几小时内复制出

4、上百万份的时内复制出上百万份的DNADNA。解决了因为样品中解决了因为样品中DNADNA含量太含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。低而难以对样品进行分析研究的问题。快速、高效、灵活、易操作。快速、高效、灵活、易操作。特点：特点：Plymerase ChainDNADNA分子的分子的-OH-OH端为端为3 3/ / ; ; 磷酸基团的末端为磷酸基团的末端为5 5/ /3355一、基础知识（一）一、基础知识（一）PCRPCR原理原理 1 1、细胞内、细胞内DNADNA的复制的复制（1 1）DNADNA由两条由两条反向反向平行平行的脱氧核苷酸长链盘旋而成的。的脱氧核苷酸长链盘旋而成的。？两个脱氧

5、核苷酸通过两个脱氧核苷酸通过3-5磷酸二酯键磷酸二酯键连接连接识别识别解旋：解旋：形成子链形成子链:解旋酶催化，氢解旋酶催化，氢键断裂键断裂以母链为模板，在以母链为模板，在DNADNA聚合酶聚合酶的催化下，利用游离的脱氧核的催化下，利用游离的脱氧核苷酸进行碱基配对苷酸进行碱基配对母链母链子链子链子代子代DNADNA1 1、细胞内、细胞内DNADNA的复制的复制 （2 2）复制所需的物质及作用：）复制所需的物质及作用：方向？还需方向？还需什么物质？什么物质？DNADNA聚合聚合酶特性？作用？酶特性？作用？引物？引物？（）子链形成（）子链形成不能从头开始合成子链，只能催化不能从头开始合成子链，只能

6、催化从引物的游离从引物的游离33一一OHOH上连接脱氧核上连接脱氧核苷酸形成磷酸二酯键。苷酸形成磷酸二酯键。按按5353的的方向方向延长。延长。 一小段单链的一小段单链的DNADNA或或RNARNA，能，能与母链的一段碱基序列互补配对。与母链的一段碱基序列互补配对。通常为通常为20302030个核甘酸个核甘酸方向？方向？引物引物DNADNA聚合酶聚合酶1、细胞内、细胞内DNA的复制（小结）的复制（小结）模板模板 亲代亲代DNADNA解开双链解开双链 解旋酶解旋酶子链形成子链形成 DNADNA聚合酶聚合酶 引物引物原料原料 四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸能量能量 ATP 过程及需要的物质？过程及需

7、要的物质？高温为什么能使高温为什么能使DNADNA解旋？解旋？耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶如何筛选？聚合酶如何筛选？引物结合、引物结合、 DNADNA聚合酶最适温度是多少聚合酶最适温度是多少? ?体外合成体外合成DNADNA？需扩增的需扩增的DNADNA高温高温90959095DNADNA聚合酶聚合酶（耐高温）（耐高温）人工合成引物人工合成引物 四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸ATPDNA双链双链单链单链变性（加热变性（加热80-100 ）复性（缓慢冷却）复性（缓慢冷却）2 2、 DNADNA复制的人工控制复制的人工控制（1 1）DNADNA的热变性的热变性控制温度控制解旋与结合控制温度控制

8、解旋与结合 （2 2）耐高温的耐高温的TaqDNATaqDNA聚合酶从水生耐热细菌中筛选。提聚合酶从水生耐热细菌中筛选。提高了效率，高了效率，PCRPCR趋于自动化趋于自动化. .DNADNA聚合酶最适温度是聚合酶最适温度是70757075高温为什么能使高温为什么能使DNADNA解旋？解旋？引物结合、引物结合、 DNADNA聚合酶最适温度聚合酶最适温度? ?耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶如何筛选？聚合酶如何筛选？( (利于引物与母链结合，利于引物与母链结合，55 55 最好最好) )94 94 最好最好) )3.PCR3.PCR需要的物质及条件需要的物质及条件6 6）自动调控控制温度的仪）

9、自动调控控制温度的仪器，使器，使DNA DNA 变性（变性（90959095） 复性（复性（55 55 ） 延伸延伸72 72 。1 1）需扩增的模板）需扩增的模板DNADNA2 2）耐高温的）耐高温的DNADNA聚合酶聚合酶3 3）与两条模板链互补的引物）与两条模板链互补的引物4 4）原料（四种脱氧核苷酸）原料（四种脱氧核苷酸）5）一定的缓冲液）一定的缓冲液 放什么物质？什么条件？为什么？放什么物质？什么条件？为什么？什么是什么是PCRPCR的三步曲？的三步曲？（1）PCR循环循环-变性变性9494变性变性（二）（二）PCR三步曲三步曲 条件及结果？条件及结果？（1）PCR循环循环-变性变性

10、（1）PCR循环循环-变性变性9494变性变性（2）PCR循环循环复性（退火）复性（退火）5555复性复性（3）PCR循环循环延伸延伸（3）PCR循环循环延伸延伸PCR 预变性预变性变变 性性9430s延伸延伸 721min退火退火 5530s945min控制温度控制温度变化的温变化的温控设备控设备1 1）需扩增的模板）需扩增的模板DNADNA2 2）耐高温的）耐高温的DNADNA聚合酶聚合酶3 3）与两条模板链互补的引物）与两条模板链互补的引物4 4）原料（四种脱氧核苷酸）原料（四种脱氧核苷酸）5）一定的缓冲液）一定的缓冲液复制复制n n次，要放多少原次，要放多少原料和引物？引物特点？料和引

11、物？引物特点？形成多少产物？产物形成多少产物？产物完全相同吗？完全相同吗？第一次解旋高温的时间长？第一次解旋高温的时间长？模板链会结合吗？模板链会结合吗？MULLISMULLIS教授是个兴趣广泛，爱好户外活动、性格特殊的人，一次外出的返家教授是个兴趣广泛，爱好户外活动、性格特殊的人，一次外出的返家途中，他驾驶着汽车在一条弯曲的山路上，在汽车开始驶入平坦笔直的公路途中，他驾驶着汽车在一条弯曲的山路上，在汽车开始驶入平坦笔直的公路时，他突然联想：已经经过的山路好像是折叠缠绕的时，他突然联想：已经经过的山路好像是折叠缠绕的DNADNA双螺旋，被热变性成双螺旋，被热变性成两条解开的两条解开的5353的

12、单链就是山脚下平坦笔直的上车道，它们可以是的单链就是山脚下平坦笔直的上车道，它们可以是DNADNA合合成的模板，如果正在行驶的小汽车代表了一小段成的模板，如果正在行驶的小汽车代表了一小段DNADNA引物，加入的引物，加入的DNADNA聚合酶聚合酶和和4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸. .正是他开汽车时的联想，使他以后发明了正是他开汽车时的联想，使他以后发明了PCR.PCR.(1) (1) 在合适位置写出在复性步骤中另种引物。在合适位置写出在复性步骤中另种引物。HOAG5(2)(2)某同学设计的两组引物都不合理，请分别说明理由。某同学设计的两组引物都不合理，请分别说明理由。引物引物II自身折叠后会

13、出现局自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效部碱基互补配对而失效引物引物I I和引物和引物局部发生局部发生碱基互补配对而失效碱基互补配对而失效(三）难点解析三）难点解析1 1、引物、引物引物之间及引物之间及引物内部碱引物内部碱基勿互补基勿互补特点？特点？种类？种类？书写？书写？2种种 从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A A的的DNADNA片段所占的片段所占的比例为比例为 。在第在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的酸链等长的DNADNA片段。片段。(三）难点解析三）难点解析 1 1、引物、引物2n n2n n

14、X22X22DNADNA的数量的数量= =需要需要引物的数量引物的数量= =15/163 3数量？数量？第几次循环有短产物链？第几次循环有短产物链？第几次出现两条均为短产物？第几次出现两条均为短产物？两条均为短产物的数量公式？两条均为短产物的数量公式？2；3；2n n2n2n；子代；子代DNADNA单链中只有两条无单链中只有两条无引物，其余均含引物。处于两引物之引物，其余均含引物。处于两引物之间的间的DNADNA序列呈指数增长。序列呈指数增长。达标测评达标测评1、关于、关于PCR技术的应用，错误的一项是技术的应用，错误的一项是A 古生物学、刑侦破案、古生物学、刑侦破案、DNA序列测定序列测定B

15、 诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学C DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案序列测定、基因克隆、刑侦破案D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定序列测定2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？伸？从子链的从子链的5端向端向3端延伸端延伸“X“X基因基因”是是DNADNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCRPCR技技术特异性地拷贝术特异性地拷贝“X X基因基因”，需在，需在PCRPCR反应中加入两种引物，两种反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结

16、合位置如图引物及其与模板链的结合位置如图1 1所示。经所示。经4 4轮循环后产物中有轮循环后产物中有五种不同的五种不同的DNADNA分子，如图分子，如图2 2所示，其中第所示，其中第种种DNADNA分子有几个：分子有几个：A A、2 B2 B、4 C4 C、6 D6 D、8 8（2 2）用）用微量移液器微量移液器按配方在微量离心按配方在微量离心管中依次加入各组管中依次加入各组分（要更换枪头）分（要更换枪头）（3 3）盖严）盖严离心管离心管口口的盖子，用手指轻的盖子，用手指轻轻弹击管壁（轻弹击管壁（混合混合）（4 4）将微量离心管）将微量离心管放在放在离心机离心机上（上（离离心）心）（5 5）将离心管放入）将离心管放入PCRPCR仪仪上，设置好上，设置好PCRPCR仪的循环程序仪的循环程序（反应反应）三、结果分析与评价三、结果分析与评价1 1、原理：、原理：DNADNA在在260nm260nm的紫的紫外线