过氧化氢酶活性测定1

1、实验 48 过氧化物酶活性的测定（比色法）   过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。 一、原理 在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在 470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量 470 nm 的吸光度变化测定过氧化物酶活性。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 马铃薯块茎。 （二）试剂 1 100 mmol L 磷酸缓冲液 pH6.0 （见附录）。 2 反应混合液： 100

2、mmol L 磷酸缓冲液（ pH6.0 ） 50 mL 于烧杯中，加入愈创木酚 28 l ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入 30 % 过氧化氢 19 l ，混合均匀，保存于冰箱中。 （三）仪器设备 分光光度计，研钵，恒温水浴锅， 100 mL 容量瓶，吸管， 离心机。 三、实验步骤 1 称取植物材料 1 g ，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以 4000 r min 离心 15 min ，上清液转入 100 mL 容量瓶中，残渣再用 5 mL 磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。 2 取光径 1 cm 比色杯 2 只

3、，于 1 只中加入反应混合液 3 mL 和磷酸缓冲液 1mL ，作为对照，另 1 只中加入反应混合液 3 mL 和上述酶液 1mL （如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长 470 nm 下吸光度值，每隔 1min 读数一次。 四、结果计算 以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 A 470 /min · g （鲜重） 表示之。也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。 过氧化物酶活性 u/ （ g · min ） = 式中： A 470 反应时间内吸光度的变化。 W 植物鲜重， g 。

4、V T 提取酶液总体积， mL 。 V s 测定时取用酶液体积 , mL 。 t 反应时间， min 。 POD（过氧化物酶）活性的测定使用愈创木酚比色法。（1） 酶液提取（2） 活性测定2.9mL 0.5mol/L pH 6.0磷酸缓冲液，加入1mL 0.05mol/L愈创木酚和0.1mL酶提取液，30水浴保温15min后迅速放入冰浴中，立即加入1mL 2%的H2O2（0.667mL 30% H2O2溶于100mL蒸馏水，现配现用。）激活反应，立即在470nm下测定吸光度值，每隔30s记录一次吸光度，共记录5次。试验重复2次取平均值记录。（3） 酶活力的计算：以每秒钟内OD值变化0.01为一

5、个酶活力单位（U），酶活性用U/(mg·min)表示。其中：-反应时间内吸光度的变化值-稀释倍数（，其中取用体积为0.1mL）-反应时间（本实验为30S）愈创木酚法称取一定质量的植物材料放入研钵中，加入提取液1 mL(0. 05 mol /L pH 5. 5 的磷酸缓冲液) ，研磨，再加入9 mL 提取液，将匀浆全部转入离心管中，4 000 r /min 4 离心10 min，上清液即酶的粗提取液。测定酶活性时，将4 mL 反应混合液( 磷酸缓冲液2 mL、酶液1 mL、0. 05 mol /L 愈创木酚1 mL)和1 mL 2% H2O2加入试管中立即摇匀并迅速倒入比色皿中，于47

6、0 nm 波长下用U-2800 型紫外可见分光光度计比色，立刻记录吸光度值，以后每30 s 记录1次，记录4 min，以缓冲液代替酶液作对照，POD 活性=V1·OD/0. 01V2W·t式中:OD 为反应初速度阶段的吸光度差，比色波长470 nm;t 为OD 对应的时间(min) ;OD /t 为直线部分的斜率，在此阶段吸光度与反应时间成正比;V1为提取酶液总体积(mL) ;V2为测定时取用的提取酶液体积(mL) ;W 为植物样品鲜重( g) ;0. 01 为以吸光度值(OD) 变化0. 01 为1 个酶活性单位( u)。过氧化氢酶活性的测定取0.2去壳种子，液氮中研磨成粉，然后加入提取液(50 mmol/L，pH 7.0 的磷酸缓冲液，20%甘油，1 mmol/L 还原型谷胱甘肽，2 mmol/L 抗坏血酸，1%聚乙烯吡咯烷酮)5 mL 继续研磨成匀浆，4 ，10 000 r/min 离心15 min. 在1 mL 反