蛋白和正链DNA组成；不裂解宿主细胞,但抑制其生长

1、（一）生物结构（一）生物结构 外形呈丝状由外壳外形呈丝状由外壳包装蛋白包装蛋白和和正链正链DNA组成；不裂解宿主细组成；不裂解宿主细胞，但抑制其生长。胞，但抑制其生长。DNA全长全长6407个核苷酸个核苷酸约有约有10个基因个基因 大肠杆菌的大肠杆菌的M13M13单链噬菌体单链噬菌体DNADNA M13噬菌体载体 M13是一种含单链（+）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。 这类载体主要用来获得大量的单链DNA片段，主要用来测定DNA序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。在 M13 基因组中，除基因间隔区（IS region）

2、外，其他均为复制和组装所必需的基因。外源 DNA 插入 IS 区，可不影响 M 13 活动，因而野生型 M 13 的改造主要在 IS 区中进行。 M13噬菌体的特点 u 感染Ecoli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型DNA （ replication form DNA, RF DNA）。可以象质粒DNA那样在体外进行纯化和操作。 u 无论是RF DNA或ss DNA都能转染E.coli的F+或F-细胞。 u 噬菌体颗粒的大小是受其DNA的大小制约的，这一点正好与噬菌体相反，所以M13噬菌体并不存在包装限制的问题。 M13噬菌体产生单双链DNA的机制 1、以（+）链DNA为摸板，合成互补（）链

3、，该双链称复制型DNA（RFDNA）。 2、RFDNA在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个细胞约200个拷贝。 3、单链特异的DNA结合蛋白结合在（+）链上，从而阻断了其互补链，即（）链的合成，这样，细胞就会不断的合成（+）链DNA 。 4、游离出来的（+）链DNA先与基因V的编码产物形成特异的DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因V的蛋白质从（+）DNA链上脱落下来，余下的M13（+）链DNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。 M13 DNA载体的构建载体的构建插入一段lac DNA片段，即带有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列及其N端

4、头146个aa编码信息，宿主F因子携带缺失第11-41位氨基酸的lacZ M13mp 载体系列M13 DNA载体的特点载体的特点1 1、克隆的克隆的DNA片段以片段以特定单链特定单链的形式输出受体的形式输出受体细胞外，在细胞外，在DNA定向突变定向突变中非常有用中非常有用.2 2、M13M13重组体筛选简便重组体筛选简便可以利用可以利用菌落的蓝白斑菌落的蓝白斑筛选转染的转化子筛选转染的转化子 3、制备的、制备的单链单链DNA、双链、双链RF-DNA M13噬菌体，噬菌体，不经体外包装，可以转染大肠杆菌受体。不经体外包装，可以转染大肠杆菌受体。噬菌体载体和质粒载体比较单纯以噬菌体为基础构建的载体

5、: 装载量大， 能排斥空载体， 转染效率高, 操作较难， DNA不稳定。 单纯以质粒为基础构建的载体: 有天然的抗性选择标记， 操作容易（易于分离和转化）， 较稳定, 装载量小， 转化效率较低； 第一节第一节 克隆载体克隆载体1. 1. 质粒载体（质粒载体（plasimid vectorsplasimid vectors）2. 2. 噬菌体载体（噬菌体载体（phage vectorsphage vectors）3. 3. 柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（cosmid vectorscosmid vectors） 4. 4. 人工染色体载体（人工染色体载体（B/Y/HACB/Y/HAC）（一）（一）

6、柯柯斯质粒的构建斯质粒的构建柯斯质粒：柯斯质粒：一类人工构建一类人工构建的含有的含有DNA两端两端cos序序列列和和质粒复制子质粒复制子的特殊类的特殊类型的载体。型的载体。 柯斯质粒（柯斯质粒（cosmidcosmid）组成：组成：抗性标记、质粒复抗性标记、质粒复制起始部位、限制型内切制起始部位、限制型内切酶切位点、酶切位点、cos粘性末端粘性末端（二）柯斯质粒的特点（二）柯斯质粒的特点1、具有具有噬菌体的特性。噬菌体的特性。 具有具有cos位点位点，能像，能像-DNA一样一样体外包装体外包装，并高效导入受体细胞。，并高效导入受体细胞。2、具有质粒载体的持性。具有质粒载体的持性。可以在受体细胞

7、内可以在受体细胞内 自由复制，自由复制，以质粒DNA的形式存在于细胞内。 3、 具有高容量的克隆能力。具有高容量的克隆能力。可以装载比质粒或可以装载比质粒或-DNA大得多的外源大得多的外源DNA片段，片段，40kb。4、 便于筛选：便于筛选：携带质粒的选择标记携带质粒的选择标记 。5、便于克隆：便于克隆：有质粒上的多种单一酶切位点。有质粒上的多种单一酶切位点。6、不能体内包装，不裂解受体细胞，不能体内包装，不裂解受体细胞，在细胞内不能形成噬菌体颗粒，因而不能形成噬菌斑 。利用利用Cos质粒进行克隆质粒进行克隆黏粒载体的克隆原理及步骤 1分离外源DNA片段3545kb 2外源DNA与两个粘粒相连

8、，且cos方向相同 3体外包装：在的A蛋白的功能作用下切割cos位点并将其中的DNA包装到成熟的噬菌体颗粒中去 4感染E.coli：线状的重组DNA被注入细胞并通过cos位点的环化，而形成黏粒载体，象质粒一样复制C2XB(6.6 kb)COSCOSSm B HCEAmpr COSpJB8(5.4 kb)PE B ECHSm A常用黏粒载体结构图 噬菌粒载体 由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。 它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。 用于体

9、外转录pBluescript噬菌粒载体T7T3常用噬菌粒载体的一般特征第一节第一节 克隆载体克隆载体1. 1. 质粒载体（质粒载体（plasimid vectorsplasimid vectors）2. 2. 噬菌体载体（噬菌体载体（phage vectorsphage vectors）3. 3. 柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（cosmid vectorscosmid vectors） 4. 4. 人工染色体载体（人工染色体载体（B/Y/HACB/Y/HAC） 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb 的DNA片段， 此时柯斯质粒(45kb)和噬菌粒载体的装载量也远远不能满

10、足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体， 它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 或称为自主复制序列(ARS)人工染色体克隆载体人工染色体克隆载体（artificialartificial chromosome vectorchromosome vector） 人工染色体载体（artificial chromosome vector）:利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。 实际上是一种“穿梭”克隆载体，含有质粒克隆载体所必备的第一受体(

11、大肠杆菌)源质粒复制起始位点(ori)，还含有第二受体(如酵母菌)染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。 与其他的克隆载体相比，人工染色体克隆载体的特点是能容纳长达1000kb甚至3000kb的外源DNA片段。 （一）酵母人工染色体（一）酵母人工染色体（YAC） 把酵母染色体与基因复制和表达有关的主要组件都组装在把酵母染色体与基因复制和表达有关的主要组件都组装在质粒上，令质粒行使酵母质粒上，令质粒行使酵母chr的转录功能和复制功能。的转录功能和复制功能。 装载量为装载量为350-400kb含有的元件：含有的元件：酵母酵母4号染色体的复制起点和着丝粒序列号染色体的

12、复制起点和着丝粒序列四膜虫大核四膜虫大核rDNA分子末端分子末端端粒重复序列端粒重复序列质粒复制起点质粒复制起点质粒选择标记质粒选择标记酵母系统的选择标记酵母系统的选择标记克隆位点：位于克隆位点：位于sup4基因内基因内 SuP4是一个是一个赭石突变（赭石突变（UAA）抑制基因。）抑制基因。 宿主酵母菌的宿主酵母菌的胸腺嘧啶胸腺嘧啶合成基因带有一个合成基因带有一个赭石突赭石突变变 ade2。在在赭石突变宿主赭石突变宿主中，没有外源基因插入时，中，没有外源基因插入时，sup4基因基因抑制赭石突变，则形成正常抑制赭石突变，则形成正常白色菌落白色菌落；有有外源基因插入时外源基因插入时，sup4基因遭

13、破坏，则形成基因遭破坏，则形成红色菌落红色菌落，十分容易挑选出有，十分容易挑选出有DNA插入片段的插入片段的红红色菌落，色菌落，建成建成YAC文库。文库。 pYAC3酵母人工染色体的使用酵母人工染色体的使用1. 载体用BamHI和SnaBI双酶切，形成3个片段。 2. 移去BamHI之间的片段，留下另外两段，每一段的两端都分别是TEL序列和SnaBI位点。 3. 被克隆的DNA，两端必须切成平末端(SnaBI是一个平末端内切酶，识别TACGTA序列)。 4. 把三者连接起来，形成了人工染色体。 酵母人工染色体的使用酵母人工染色体的使用 用pYAC3进行克隆筛选如下： u用原生质转化的方法把人工

14、染色体转入酿酒酵母。用作宿主的菌株是双营养缺陷型Trp1-ura3- ，可以被人工染色体上的筛选标记基因恢复成Trp1+ura3+ 。 u 在基本培养基平板上培养，只有含有结构正确的人工染色体的转化体可以生存。 u 如果染色体构建错误，如在被克隆的DNA两侧连接了相同的两段载体DNA片段，则因缺少一种筛选标记，使得转化体不能在基本成分培养基上存活。 u 外源DNA的是否插入，可由SUP4的插入失活判断，即可以很简单地由菌落的颜色看出：红色的菌落是重组体，而白色的菌落则不是。酵母人工染色体（酵母人工染色体（YAC）缺点）缺点1、插入片段大，稳定性差、插入片段大，稳定性差2、内部存在、内部存在重组和嵌合重组和嵌合现象现象3、YAC 染色体与宿主细胞的染色体大小相近，染色体与宿主细胞的染色体大小相近，影响了影响了YAC 载体的广泛应用载体的广泛应用 （二）细菌人工染色体（二）细菌人工染色体（BAC）在大肠杆菌性因子在大肠杆菌性因子F质粒质粒的基础上构建的，的基础上构建的，在大肠杆菌受体菌在大肠杆菌受体菌维持单一拷贝维持单一拷贝，装载量范围，装载量范围在在50-300kb之间。之间。用于：克隆大型