乳酸菌的分类鉴定

1、乳酸菌的分类鉴定时间：2013年11月乳酸菌目前发 现乳酸菌主要有包括n乳杆菌属（Lactobacillus ）、n链球菌属（Streptococeus）、n明串珠菌属（Leuconostoc）、n双歧杆菌属（Bifidobacterium）、n片球菌属（Pediococcus） 等在内的至少 23 个属。n每个属下面又发现若干个菌种，菌种下面还有若干亚种，属于革兰氏阳性菌乳酸菌鉴定方法n有表型鉴定法（经典方法）和分子标记鉴定法。n表型鉴定法操作方便、成本低，但不能反应乳酸菌的遗传性信息；n分子标记法快速，但成本相对较高，而且测定的结果与前两者有不一致的现象。n所以不能只用一种方法对乳酸菌进行

2、鉴定与分类，几种方法结合起来综合判断可能更加准确。一、表型鉴定：两歧法二、分子水平： n基于PCR的DNA指纹图谱技术n基于rRNA序列的分子标记技术n种间特异性PCR一、生化鉴定：两歧法 鉴定对象株 共通项目：共16项 实验结果记录 属间鉴定项目（定属） 种间鉴定项目 判定种 不能判定种 不能判定种 重复种的鉴定（n1） 追加试验项目(耐盐性试验、精氨酸产气、肽聚糖类型) 判定种 重复种的鉴定（n2,n1n2） 肽聚糖类型、GC%测定 判定种 重复种的鉴定 DNA同源性 判定种共通项目（16项）：1.生长状态观察2.革兰氏染色3.细胞的形态观察4.H2O2酶试验5.硝酸盐还原试验6.石蕊牛乳

3、试验7.明胶液化试验8.运动性试验9.葡萄糖产气试验10.pH生长试验11.温度生长试验12.糖发酵试验13.发酵蔗糖产葡聚糖14.发酵类型15.乳酸旋光性16.细胞壁中肽聚糖类型17.精氨酸产气18.耐盐性、好盐性试验标准菌株: 各种生化特性已研究清楚的标准菌株，可用于检测试验的准确性和可靠性。 分离菌株（分离菌株（G+杆菌）杆菌） 过氧化氢酶（过氧化氢酶（- -） 过氧化氢酶（过氧化氢酶（+） 芽孢（芽孢（+ +） 芽孢（芽孢（- -） 非乳酸菌非乳酸菌 Sporolactobacillus 同型发酵同型发酵 异型发酵异型发酵 Lactobacillus Lactobacillus Lac

4、tobacillus Carnobacterium 乳酸菌的分属乳酸菌的分属 分离株（球菌）分离株（球菌） 链状链状 四联四联 同型发酵同型发酵 异型发酵异型发酵 过氧化氢酶过氧化氢酶 过氧化氢酶过氧化氢酶 （+ +） （- -）Streptococuus Leuconostoc Enterococcus Pediococcus 非乳酸菌非乳酸菌 Lactococcus Streptococcus以明串珠菌属为例，介绍种的鉴定异性发酵乳酸链状球菌Leuconostoc 发酵蔗糖产酸（发酵蔗糖产酸（+ +） 发酵蔗糖产酸发酵蔗糖产酸(-)(-) 发酵蔗糖产葡聚糖发酵蔗糖产葡聚糖 pH4.8pH4

5、.8生长试验；发酵果糖生长试验；发酵果糖 发酵阿拉伯糖发酵阿拉伯糖 发酵阿拉伯糖发酵阿拉伯糖 （+ +） （- -） 群群3 群群4 群群5 发酵海藻糖发酵海藻糖 群群1 群群2 （+ +） （- -） 群群6 6 群群7 7群1：Leuc.oenos群2：Leuc. mesenteroides subsp.cremoris群3： Leuc. mesenteroides subsp.mesenteroides群4： Leuc. mesenteroides subsp.dextranicum 群5： Leuc. paramesenteroides Leuc. mesenteroides subs

6、p.mesenteroides群6： Leuc. paramesenteroides Leuc. mesenteroides subsp.cremoris群7：Leuc. lactisn注： 方框框起来的是用一般生理生化试验区分比较困难的，需进一步做分子水平的鉴定；二、分子水平的鉴定n基于PCR的DNA指纹图谱技术n基于rRNA序列的分子标记技术n种间特异性PCR（一）基于PCR的DNA指纹图谱技术1.限制性片段长度多态性分析（RFLP）n优缺点： 种内水平，在亚种水平的鉴定优16srRNA；2.随机扩增多态性DNA分析（RAPD）n优缺点： 简单、检测速度快，不需要知道基因组DNA的任何序列

7、信息即可分析；对反应条件敏感，重复性差，难以达到种的水平；3.扩增片段长度多态技术（AFLP）n优缺点：重复性好，分辨率高，在亚种和菌株水平上对菌株进行鉴定；对操作和设备要求高；4.基因组简单重复序列PCR标记（Re-PCR）n优缺点：重复性好，可在亚种和菌株水平上对菌株进行快速而准确的分类和鉴定；5.变性梯度凝胶电泳/温度梯度电泳（DGGE/TGGE）n优缺点：DNA用量小，重复性好，但通常只能检测微生物群落中数量大于一定值得优势种群。（二）基于rRNA序列的分子标记技术 原核生物rRNA有3种类型：23srRNA、16srRNA 、5srRNA，对应约含有2900、1540、120个碱基。

8、rRNA 结构既具保守性又具高变性。保守性反映生物物种的亲缘关系, 高变性则揭示生物物种的特征核酸序列, 是属种鉴定的分子基础。1.16srDNAn 通过用特定引物进行PCR扩增，测序后获得16srDNA的部分或全部序列，再与数据库中序列数据进行比对，分析其在发育树中的位置； 400600碱基的序列足以对环境中微生物的多样性和种群分类进行初步的估计, 但这样短的序列通常不能用于新物种鉴定和探针设计。n鉴定：属种水平，不能鉴定种内；n引物：通用引物（肠道细菌及其相关细菌） F:ccgaattcgtcgacaac R:agagtttgatcatggctcac全长引物（扩增产物约为1500bp） F：agagtttgatcctggctcag R：aaggaggtgatccagcc2.1623srDNAn不同菌株1623srDNA基因间隔区有相当好的保守性