如何构建质粒克隆

1、如何构建质粒克隆如何构建质粒克隆周鸿雁周鸿雁2011.06.152011.06.15目的基因目的基因目的载体目的载体BaxpCMV-Sport 6EcoRBgl连接连接BaxBax基因至基因至EGFPEGFP载体载体 思路思路加入加入 EcoREcoR酶切位点酶切位点加入加入 Bgl Bgl 酶切位点酶切位点连接连接酶切酶切目的基因目的基因两侧加入两侧加入酶切位点酶切位点MCS多克隆位点多克隆位点 BaxpCMV-Sport 6: Flag、 HA、 MycpCMVSPORT6 MCSGene： BAX MGC: 20956, IMAGE:4578562Insert site：EcoRI, X

2、hoI 构建过程构建过程 设计引物设计引物 ( (增加酶切位点增加酶切位点, Bgl, EcoR), Bgl, EcoR) 目的基因目的基因PCRPCR 双酶切载体双酶切载体 (Bgl, EcoR)(Bgl, EcoR) 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 DNA DNA 胶回收胶回收 ( ( 基因基因 , ,载体载体) ) 双酶切目的基因双酶切目的基因 (Bgl, EcoR)(Bgl, EcoR) 目的基因与载体相连目的基因与载体相连 DH5DH5转化转化 鉴定鉴定第一步：第一步：设计目的基因设计目的基因PCRPCR引物引物目的：目的：1 1）通过）通过PCRPCR方法扩增目的基因方法扩增目的基因

3、2 2）在目的基因片断两端增加酶加位点）在目的基因片断两端增加酶加位点设计引物前需解决的问题设计引物前需解决的问题 1 1、选择酶切位点、选择酶切位点 2 2、选择保护碱基、选择保护碱基 3 3、终止密码子、终止密码子PEGFP MCS选择酶切插入位点：选择酶切插入位点：1、两个酶切位点间隔、两个酶切位点间隔远远2、目的基因序列中无、目的基因序列中无相应酶切位点相应酶切位点3、酶切缓冲液一致、酶切缓冲液一致BAX insert sequence atggacgggtccggggagcagcccagaggcggggggcccaccagctctgagcagatcatgaagacaggggccctt

4、ttgcttcagggtttcatccaggatcgagcagggcgaatggggggggaggcacccgagctggccctggacccggtgcctcaggatgcgtccaccaagaagctgagcgagtgtctcaagcgcatcggggacgaactggacagtaacatggagctgcagaggatgatt gccgccgtggacacagactccccccgagaggtctttttccgagtggcagctgacatgttttctgacggcaacttcaactggggccgggttgtcgcccttttctactttgccagcaaactggtgctcaaggccct

5、gtgcaccaaggtgccggaactgatcagaaccatcatgggctggacattggacttcctccgggagcggctgttgggctggatccaagaccagggtggttgggacggcctcctctcctactttgggacgcccacgtggcagaccgtgaccatctttgtggcgggagtgctcaccgcctcactcaccatctggaagaagatgggctgaenzymeenzymeBAXBAXbufferbufferSal Sal 0 0XhoXho1 12,3,42,3,4EcoR EcoR 0 01,2,3,41,2,3,4BamHBamH

6、1 1Bgl Bgl 0 03 3PstPst0 0BclBcl0 0*DNAStar软件软件 - MapDraw功能功能AGATCT - Bgl buffer 3 GAATTC -EcoR I buffer 3AGATCT AGATCT 目的基因目的基因 CTTAAG CTTAAG PCRPCR产物产物酶切位点保护碱基酶切位点保护碱基protection seqence: GGAAGATCTTCC 2h=25%, 20h90% CCGGAATTCCGG 2h90%, 20h90%切割率切割率保护碱基保护碱基: : 限制性内切酶限制性内切酶识别特定的识别特定的DNADNA序列，除此之外，酶蛋白

7、还序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNADNA双链并发挥切割双链并发挥切割DNADNA作用是有很大影响作用是有很大影响设计引物原则设计引物原则 引物的长度一般为引物的长度一般为15-30 bp15-30 bp，常用的是，常用的是18-27 bp18-27 bp，引物序列的引物序列的GCGC含量一般为含量一般为40-60%40-60%2. 2. 引物所对应模板位置序列的引物所对应模板位置序列的TmTm值在值在7272左右可使复左右可使复性条件最佳性条件最佳3. 3. 避免引物二聚体及发

8、夹结构避免引物二聚体及发夹结构4. 4. 引物的特异性引物的特异性5. 5. 碱基随机分布碱基随机分布 cggcgg tgatggacgg gtccggggag cagcccagag gcggggggcc Primer1 ATGGACGGGTCCGGGGAGCAG (length -21, GC%-71.8%, Tm-71.4) ggag tgctcaccgc ctcactcacc atctggaaga agatgggctg aggcccccag Primer2 TCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG (length -25, GC%-52%, Tm-68.4)设计引物设计引物 P

9、rimer 5Primer 5软件软件 引物中是否应包含终止密码子？引物中是否应包含终止密码子？加入保护碱基及酶切位点加入保护碱基及酶切位点 Primer 1 GGAAGATCT ATGGACGGGTCCGGGGAGCAG Primer 2 CCGGAATTC TCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG MCSMCS与荧光相连的地方应特别注意有无移码与荧光相连的地方应特别注意有无移码调整开放阅读框（调整开放阅读框（ORF）荧光表达在前时荧光表达在前时(EGFP) Primer1 GGAAGATCTATGGACGGGTCCGGGGAGCAG Primer2 CCGGAATTCTCAGCC

10、CATCTTCTTCCAGATGGTG 因因TGA为终止密码子，所以之后的移码不需理会为终止密码子，所以之后的移码不需理会荧光表达在后时荧光表达在后时 (DsRed) Primer1 CCGGAATTCatggaggcgctaattcctgtc Primer2 CGCGGATCCCGccaaagatgagtctcccgg荧光表达在后时需加荧光表达在后时需加KOZAKKOZAK 序列序列 Primer1 CCGGAATTCgccaccatggaggcgctaattcctgtc Primer2 CGCGGATCCCGccaaagatgagtctcccgg KOZAK KOZAK 序列序列: : g

11、ccacc, 加在起始密码子之前加在起始密码子之前Primer final Primer1 GGAAGATCTATGGACGGGTCCGGGGAGCAG Primer2 CCGGAATTCTCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG33.5 uL dH2O10 uL phusion HF buffer1 uL dNTP(10mM)2.5uL primer forward/ reward 1uL BAX 1.5ul DMSO0.5uL phusion polymerase 50 uL 1. 98(1min)2. 98 (5s)3. 65(20s) 4. 72(20s)5. back to

12、step 2 for 25 times6. 72 (10min)7. 18 for ever第二步：第二步：PCRPCR目的基因目的基因PhusionPhusion超保真超保真PCRPCR试剂盒试剂盒Buffer3 : 2ulvector: 4ul100%BSA: 0.2ulEcoR : 1ulBgl: 2ulddH2O: 10.8ul37 4hEcoRBgl第三步：双酶切载体第三步：双酶切载体20ul第四步：琼脂糖凝胶电泳、第四步：琼脂糖凝胶电泳、凝胶回收凝胶回收 0.6% gel 6* loading buffer 50ul sample 80V 目的基因5kb2.5kb载体琼脂糖浓度%D

13、NA分离范围0.35600.61200.70.8100.90.571.20.461.50.23Buffer3 : 2ulBAX: 15ul100%BSA: 0.2ulEcoR : 0.5ulBgl: 1ulddH2O: 1.3ul37 4h第五步：双酶切及回收目的基因第五步：双酶切及回收目的基因20ulTAKARATAKARA片断回收试剂盒片断回收试剂盒第六步：回收效率验证第六步：回收效率验证5kb2.5kbLoading volume: 5ulFrom left to right:Marker: 15000bpEGFPBAX restrictionBAX PCRMarker:100bpT4

14、ligase buffer : 2ulT4 ligase: 1ulBax: 3ul vector: 1ulddH2O: 13ulT4 ligase buffer : 2ulT4 ligase: 1ulBax : 6ul vector : 1ulddH2O: 10ulT4 ligase buffer : 2ulT4 ligase: 1ulBax : 10ul vector : 1ulddH2O: 6ul(1) (2) (3)16 过夜过夜第六步：连接第六步：连接载体载体100ng:100ng:100 x100 x目的基因分子量目的基因分子量载体分子量载体分子量X 4/110/1X 4/110/1目的基因的量为目的基因的量为: :第七步：转化第七步：转化 100ul DH5 + 20ul 连接产物第八步：验证第八步：验证 (1)(1) PCR1-1213-24Positive: 2,7,9,105.4 uL dH2O2 uL phusion HF buffer0.2 uL dNTP(10mM)0.5uL primer forward0.5 uL primer reward1uL 菌液稀释液 0.3ul DMSO0.1uL phusion polymerase 10 uL 第八步：验