以DC为基础的肿瘤疫苗策略

1、2010.12.31肿瘤疫苗和肿瘤疫苗和DCDC简史简史肿瘤细胞的免疫逃避机制和肿瘤细胞的免疫逃避机制和DCDC抗肿瘤机制抗肿瘤机制以以DCDC为基础的肿瘤疫苗策略为基础的肿瘤疫苗策略DCDC肿瘤疫苗的主要影响因素肿瘤疫苗的主要影响因素树突状细胞树突状细胞 dendritic cell; DC 1973 美国学者美国学者Steinman 小鼠的脾细胞小鼠的脾细胞因其成熟时伸出许多因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起树突样或伪足样突起而得名而得名目前所知的功能最强目前所知的功能最强的抗原提呈细胞的抗原提呈细胞CD34骨髓干细胞骨髓干细胞肿瘤疫苗肿瘤疫苗dendritic cell vaccine

2、 DC vaccine1、增强肿瘤、增强肿瘤的的免疫原性免疫原性2、增强机体、增强机体的抗肿瘤的抗肿瘤免疫免疫应答应答3、打破打破肿瘤肿瘤免疫免疫耐受耐受核核心心问问题题诱导主动性免疫诱导主动性免疫刺激宿主产生有效刺激宿主产生有效的免疫应答的免疫应答安全、无不良反应安全、无不良反应能为预防肿瘤复发能为预防肿瘤复发提供保护性的长期提供保护性的长期免疫记忆功能免疫记忆功能理理想想肿肿瘤瘤疫疫苗苗肿瘤疫苗的研究进展肿瘤疫苗的研究进展疫苗的出现疫苗的出现1796 Edward Jenner 接种疫苗接种疫苗天花天花 肿瘤疫苗尝试性研究肿瘤疫苗尝试性研究提高肿瘤自身免疫原性提高肿瘤自身免疫原性的方法的方

3、法增加机体的抗肿瘤免疫反应增加机体的抗肿瘤免疫反应1、WiUiam Coley丹毒患者的活的链球菌丹毒患者的活的链球菌注射注射肿肿瘤患者肿瘤结节内瘤患者肿瘤结节内激发起肿激发起肿瘤患者机体对肿瘤的免疫应答瘤患者机体对肿瘤的免疫应答 2、牛痘病毒牛痘病毒感染的肿感染的肿瘤细胞瘤细胞肿瘤溶解物肿瘤溶解物注射人体注射人体3、混合、混合卡介苗卡介苗或或短小短小棒状杆菌棒状杆菌+经过照射灭经过照射灭活的肿瘤细胞活的肿瘤细胞共孵共孵育育注射人体注射人体没有取得明显肯定的治疗效果没有取得明显肯定的治疗效果 理论基础的奠定理论基础的奠定1971 Burnet Thomas 免疫监视学说免疫监视学说免疫系统免疫

4、系统细胞免细胞免疫机制疫机制识别清除识别清除肿瘤细胞肿瘤细胞 临床和实验证据临床和实验证据1、免疫缺陷免疫缺陷（尤其是细胞免疫缺陷）（尤其是细胞免疫缺陷）肿瘤发生率肿瘤发生率2、幼儿期幼儿期（免疫功能未发育成熟）（免疫功能未发育成熟）和和老年期老年期（免疫功能衰退）（免疫功能衰退）肿瘤发肿瘤发生率比其他年龄生率比其他年龄3、经、经抗淋巴细胞血清处理抗淋巴细胞血清处理或或胸腺摘胸腺摘除除的小鼠肿瘤发生率高的小鼠肿瘤发生率高肿瘤疫苗研究的飞跃肿瘤疫苗研究的飞跃20世纪末世纪末 90年代年代初以初以基因修饰肿瘤细基因修饰肿瘤细胞胞为基础的疫苗发展为基础的疫苗发展 肿瘤疫苗真正成为能够应用肿瘤疫苗真正

5、成为能够应用于临床的肿瘤治疗方法于临床的肿瘤治疗方法1997年年 美国美国Jefferson大学大学 约约60的黑色素细胞瘤转移患者的黑色素细胞瘤转移患者注射肿瘤疫苗后存活注射肿瘤疫苗后存活5年以上年以上1998年年 波士顿研究人员波士顿研究人员 制成一种经生物工程改造的肿瘤制成一种经生物工程改造的肿瘤疫苗，它包含一种可以刺激机体免疫苗，它包含一种可以刺激机体免疫系统，使细胞保持较长时间的疫系统，使细胞保持较长时间的攻击力。攻击力。 （一）全肿瘤细胞疫苗（一）全肿瘤细胞疫苗 1、经物理、化学等方法处理的疫、经物理、化学等方法处理的疫苗苗 2、转基因疫苗、转基因疫苗 3、感染病毒类疫苗、感染病毒

6、类疫苗 4、细胞融合疫苗、细胞融合疫苗 （二）肿瘤抗原及抗原类分子疫苗（二）肿瘤抗原及抗原类分子疫苗该类疫苗的研究最为广泛该类疫苗的研究最为广泛,该类疫苗该类疫苗特异性高特异性高,但免疫原性低但免疫原性低 1、抗原疫苗、抗原疫苗 2、多肽类疫苗、多肽类疫苗 3、抗独特型抗体疫苗、抗独特型抗体疫苗 4、热休克蛋白、热休克蛋白肽类复合物疫苗肽类复合物疫苗 （三）核酸疫苗（三）核酸疫苗 （四）重组病毒、病菌疫苗（四）重组病毒、病菌疫苗 （五）树突状细胞疫苗（五）树突状细胞疫苗 肿瘤疫苗新热点肿瘤疫苗新热点近近10年来年来 以树突状细胞为基础的肿瘤抗原特异性疫苗以树突状细胞为基础的肿瘤抗原特异性疫苗

7、1991年年Steinman首次发现首次发现DC这一强大的抗原递呈功能这一强大的抗原递呈功能以来，以来，DC就被用于肿瘤的免就被用于肿瘤的免疫治疗研究疫治疗研究转基因疫苗转基因疫苗 表达的共刺激分子、表达的共刺激分子、细胞因子细胞因子,通过激活通过激活细胞使更多的抗原细胞使更多的抗原被摄取呈递被摄取呈递 临床试验效果不如动临床试验效果不如动物实验；物实验；瘤细胞获取复杂；瘤细胞获取复杂；灭活要求高；灭活要求高；基因导入的安全问题基因导入的安全问题 直接携带肿瘤抗直接携带肿瘤抗原的原的DC细胞作细胞作用则更为直接用则更为直接 可以活化静息细胞，可以活化静息细胞，激发更强抗肿瘤免疫激发更强抗肿瘤免

8、疫反应反应 DC疫苗疫苗 易获取，操作简便，易获取，操作简便，效果和转基因疫苗相效果和转基因疫苗相当甚至更好当甚至更好 美国密执安大学、瑞士苏美国密执安大学、瑞士苏黎世大学等应用黎世大学等应用树突状细树突状细胞胞分别携带分别携带乳腺癌乳腺癌 、黑黑色素瘤抗原色素瘤抗原制备疫苗制备疫苗Dukes大学则应用大学则应用肿瘤细肿瘤细胞转导胞转导细胞细胞均已进入均已进入期或期或期期 临临床试验。床试验。2005年年 中山大学肿瘤医院中山大学肿瘤医院研发出研发出一种一种除了干细胞移除了干细胞移植、化疗等常规治疗方法植、化疗等常规治疗方法外的白血病治疗方法外的白血病治疗方法白血病白血病DC疫苗疫苗已在已在1

9、4位患者身上获得明位患者身上获得明显疗效，显疗效，国内尚属首创国内尚属首创。 1） 肿瘤的免疫原性较弱, 并具有抗原调变能力 2）MHC-IMHC-I类分子表达下降或消失。类分子表达下降或消失。肿瘤细胞高水平表达包括唾液酸在内的粘多糖或其他的凝聚肿瘤细胞高水平表达包括唾液酸在内的粘多糖或其他的凝聚系统；血清中的封闭因子（封闭抗体）封闭肿瘤表面抗原表系统；血清中的封闭因子（封闭抗体）封闭肿瘤表面抗原表位。位。漏逸的少量肿瘤细胞不能引起足够的免疫应答，反而可以漏逸的少量肿瘤细胞不能引起足够的免疫应答，反而可以刺激肿瘤不断生长，产生免疫刺激。刺激肿瘤不断生长，产生免疫刺激。存在于某些肿瘤组织内的淋巴

10、细胞可以为肿瘤细胞提供某存在于某些肿瘤组织内的淋巴细胞可以为肿瘤细胞提供某些肿瘤营养因子并刺激肿瘤细胞生长。些肿瘤营养因子并刺激肿瘤细胞生长。 Sakaguchi 等在等在1995年发现鼠源性的年发现鼠源性的CD4CD25 双阳性双阳性T细细胞亚群，能通过细胞与细胞间接触以及分泌细胞因子显著胞亚群，能通过细胞与细胞间接触以及分泌细胞因子显著抑制多种免疫细胞的功能。抑制多种免疫细胞的功能。 局部微环境的肿瘤抗原可显著诱导特异局部微环境的肿瘤抗原可显著诱导特异Treg细胞生成，称细胞生成，称为肿瘤特异为肿瘤特异Treg细胞。细胞。 很多资料显示很多资料显示Treg细胞在肿瘤微环境及患者外周血中富集

11、细胞在肿瘤微环境及患者外周血中富集存在。存在。 肿瘤免疫抑制因子可以使肿瘤细胞躲避局部免疫效应细胞肿瘤免疫抑制因子可以使肿瘤细胞躲避局部免疫效应细胞的攻击，还能进入外周血循环，抑制宿主全身抗肿瘤免疫的攻击，还能进入外周血循环，抑制宿主全身抗肿瘤免疫功能。功能。 Lyon 小组应用小组应用“微量样本多指标流式蛋白定量技术微量样本多指标流式蛋白定量技术(Cytometric Bead Array，CBA)”对对35例确诊乳癌患者及例确诊乳癌患者及24例疑似患者的样本进行了检测对比，得出在所测的例疑似患者的样本进行了检测对比，得出在所测的IL-1B、IL-2、IL4、IL-5、IL-6、 IL-7、

12、IL-8、IL-10、IL-12 (p70)、IL-13、IL-17、G-CSF、GM-CSF、IFN-、MCP-1、MIP-1 B和和TNF-细胞因子中，除了细胞因子中，除了GMCSF，INF- 外，其他因子都外，其他因子都有显著的增高。有显著的增高。Ishigami 等的研究显示, 胃癌组织中DC数量与胃癌的淋巴结转移、临床分期和周围浸润呈负相关。 1) 未成熟未成熟DC 与肿瘤细胞的直接接触影响了与肿瘤细胞的直接接触影响了DC 的成熟的成熟; 2) 肿瘤细胞释放的可溶性免疫抑制因子影响着全身的肿瘤细胞释放的可溶性免疫抑制因子影响着全身的DC 的成熟和功能的成熟和功能, 包括包括VEGF、

13、TNF-、TGF- 、 M-CSF、GM-CSF、I L-6 和和IL-10 等等 。 肿瘤局部肿瘤局部DC 浸润数量可作为判断肿瘤预后的浸润数量可作为判断肿瘤预后的独立指标。独立指标。以DC为基础的肿瘤疫苗策略以DC为基础的肿瘤疫苗策略以DC为基础的肿瘤疫苗策略肿瘤细胞肿瘤细胞/肿瘤细胞提取物冲击肿瘤细胞提取物冲击DC1蛋白质冲击蛋白质冲击DC2肿瘤抗原肽冲击肿瘤抗原肽冲击DC3肿瘤抗原肿瘤抗原DNA/RNA冲击冲击DC4肿瘤抗原在体内冲击肿瘤抗原在体内冲击DC51.肿瘤细胞肿瘤细胞/ /肿瘤细胞提肿瘤细胞提取物冲击取物冲击DCDC1.肿瘤细胞肿瘤细胞/ /肿瘤细胞提肿瘤细胞提取物冲击取物冲

14、击DCDC1.肿瘤细胞肿瘤细胞/ /肿瘤细胞肿瘤细胞提取物冲击提取物冲击DCDCYasuda1.1.肿瘤细胞肿瘤细胞/ /肿瘤细胞提取物冲击肿瘤细胞提取物冲击DCDC2.蛋白质冲击蛋白质冲击DCDC 对于抗原表位尚不了解的肿瘤，可以可溶性蛋白作为抗原装载DC 在肿瘤动物模型和肿瘤患者中，以肿瘤抗原蛋白转染的DC在体外和体内均可诱导出针对肿瘤的抗原特异性CTL反应优点：可使那些因优点：可使那些因MHCMHC限制而排除在肽限制而排除在肽疫苗治疗之外的患疫苗治疗之外的患者受益。者受益。3.肿瘤抗原肽冲击肿瘤抗原肽冲击DCDC 以肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原肽装载DC的肿瘤疫苗4.肿瘤抗原肿瘤抗原DN

15、A/RNADNA/RNA冲冲击击DCDC 载体载体4.肿瘤抗原肿瘤抗原DNA/RNADNA/RNA冲击冲击DCDC DNA/RNA疫苗可在体外合成而大量获得，并可包含多个抗原表位，还可经修饰使其功效加强。 RNA疫苗只在宿主细胞的胞质中表达，DNA疫苗需进入细胞核后转录癌变的潜在危险 DNA疫苗稳定性好，功效长久5. 5. 肿瘤抗原在体内冲击肿瘤抗原在体内冲击DCDC肿瘤抗原GM-CSF, IL-4脂质体DC装载载抗原策略免疫佐剂剂的使用DC的体外扩扩增免疫途径径临临床病人的选择选择DC肿瘤疫苗的主要影响因素肿瘤疫苗的主要影响因素DC的来源的来源DC的分离纯化的分离纯化DC的培养基的培养基DC

16、培养使用的细胞因子培养使用的细胞因子DC细胞的鉴定细胞的鉴定DC的培养技术的培养技术DC的来源的来源骨髓骨髓取材有限，取材有限， HSC 含量极少含量极少,大约为大约为1/ 105 单个核细胞。单个核细胞。BM 为侵入性操作为侵入性操作,患者不容易接受。患者不容易接受。其增殖及多向分化能力随供者年龄增加其增殖及多向分化能力随供者年龄增加体质衰弱而减弱。体质衰弱而减弱。在体外培养过程中有自发分化和衰老的现象在体外培养过程中有自发分化和衰老的现象,且且BM 有病毒污染的可能有病毒污染的可能DC的来源的来源外周血外周血标本来源充足标本来源充足,取材方便取材方便,因子组合简单因子组合简单,培养步骤简单

17、、培养步骤简单、经济经济。HSC 含量极少含量极少, 最终收获的最终收获的DC 数量少数量少,活力和纯度均活力和纯度均不高。不高。其端粒及端粒酶活性均长于和高于其端粒及端粒酶活性均长于和高于BM 及及PB HSC/ HPC ,并且低表达或不表达细胞凋亡配基并且低表达或不表达细胞凋亡配基CD95/ Fas ,故体外生故体外生存期更长存期更长DC的来源的来源脐带血脐带血较丰富的原始且能重建长期造血的较丰富的原始且能重建长期造血的HSC/ HPC , 自我增殖及多向分化能力较强自我增殖及多向分化能力较强对刺激因子的反应和增殖能力、体外集落形成能力、刺激后进对刺激因子的反应和增殖能力、体外集落形成能力

18、、刺激后进入细胞周期的速度以及自泌生长因子能力均强于入细胞周期的速度以及自泌生长因子能力均强于BM 及及PB 的的HSC/ HPC ,脐带血脐带血优点优点缺点缺点产量大、纯度高等产量大、纯度高等母婴无不良影响母婴无不良影响,不涉及社会、伦理及不涉及社会、伦理及法律等方面的争论法律等方面的争论,受胎盘屏障保护受胎盘屏障保护,被污染概率低被污染概率低CB 量较少量较少,通常只有通常只有50150 ml ;CB HSC 对理化变化较敏感对理化变化较敏感,洗涤、分离或运用传统方法去除红细胞洗涤、分离或运用传统方法去除红细胞的方法均会导致的方法均会导致HSC的严重丢失的严重丢失分离纯化分离纯化操作简单操

19、作简单, 细胞成分复杂细胞成分复杂,多次传代后不能纯化多次传代后不能纯化,增殖活力相对较低增殖活力相对较低连续连续贴壁法贴壁法操作简单操作简单,成本低廉成本低廉,纯化率较低纯化率较低密度梯度密度梯度离心法离心法细胞纯度高细胞纯度高( 90 %) ,但操作复杂但操作复杂,价格昂贵价格昂贵,单克隆抗体选择不当单克隆抗体选择不当,容容易丢失目的细胞易丢失目的细胞免疫磁珠免疫磁珠分选法分选法联合联合DC的培养基10%胎牛血清胎牛血清引起机体免疫反应引起机体免疫反应自体单核细胞条件培养基自体单核细胞条件培养基细胞因子维持维持DC 分化、发育、存活、功能的最基本分化、发育、存活、功能的最基本的的CK,主要使主要使HSC 向向DC、单核及巨噬细胞、单核及巨噬细胞分化分化,并以生成单核细胞为主并以生成单核细胞为主GM-CSFIL-4IL-4 通过抑制单核细胞向巨噬细胞方向的分化而通过抑制单核细胞向巨噬细胞方向的分化而诱导其向诱导其向DC 方向分化方向分化IL-4 可以增加并稳固可以增加并稳固GM-CSF