AD自噬改动标红

1、二苯乙烯苷通过抑制的 Beclin-1、LC3-H表达改善APP695V717I转基因鼠的行为学障碍罗红波,石向群, 郭建魁,张志强 , 汪泳,李芸,尹榕（兰州军区兰州总医院神经内科 , 甘肃省 兰州市 730050）【摘要】目的 探讨在APP695V717I转基因鼠模型中，二苯乙烯苷（TSG）对大鼠行为学的保护作用及其对自噬分子 Beclin-1、LC3- U的表达影响。方法 选取10月龄APP695V717I 转基因小鼠40只，随机数字表法分为药物组组、模型组，各20只,药物组给予TSG灌胃1 个月,同背景同月龄C57BL/6J小鼠为正常对照组。行为学检测应用 Morris水迷宫实验和丫

2、电迷宫实验。反转录聚合酶链反应及免疫印迹法检测海马神经元自噬相关蛋白 Beclin-1 和 LC3- U的mRNA及蛋白表达变化。结果 在模型组中，大鼠丫电迷宫躲避所需的电刺激次 数增加， Morris 水迷宫测试中潜伏期延长 , 游泳路程增加及穿越平台次数减少； Beclin-1 和 LC3- U的mRNA及蛋白的表达增高，与对照组比较有统计学意义 （P<0.05）; TSG药物干预 后，大鼠躲避所需的电刺激次数减少，潜伏期缩短 , 游泳路程缩短，穿越平台次数增加； Beclin-1和LC3- U的mRNA及蛋白的表达较模型组下降（P<0.05）,差异有统计学意义。结论 二苯乙烯

3、苷可通过下调自嗜通路中Beclin-1和LC3- U的表达，以抵抗 A B的神经毒性作用对内质网功能的损害，从而改善大鼠的学习记忆、空间定向等行为学表现。【关键词】 A PP转基因小鼠；自噬；二苯乙烯苷；行为学阿尔茨海默病（Alzheimer' s disease AD）是一种神经系统变性疾病，其主要的病理学特 征之一是脑组织中出现大量老年斑 。老年斑主要由B -淀粉样蛋白（B -amyloid，A B ）形成, A B是通过淀粉样样前体蛋白（APP）的异常剪切、折叠后所形成，在细胞内，对这种异常 折叠的蛋白质，细胞可通过泛素蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome pa

4、thway, UPP）和自噬溶酶体途径来调控蛋白、细胞器的降解，从而保证蛋白质的正常工作，维持细胞功能的正常运 行。有学者早期研究发现 AD 患者在病理上表现为大量囊泡的堆积， 但这种表现的机制及其 在 AD 发病机制中的作用却没有得到明确的阐述； 2006年，有学者建立自噬途径的重要蛋 白 Apg5/Apg7 基因敲除的大鼠模型，发现该模型表现出神经变性疾病的一些表型，使得自 噬途径在神经变性疾病得到了关注和重视 2-3。本实验采用 APP695V717I 转基因 AD 动物 模型观察大鼠海马神经元自噬相关蛋白Beclin-1和LC3- U的表达情况并探讨其意义。AD患者的学习记忆及工作能力

5、的逐渐丧失给家庭及社会带来沉重的负担，但目前其治 疗尚无十分有效方法与药物 。研究显示何首乌的主要有效成分之一（ 2， 3， 5， 4-四羟基二 苯乙烯-2-0- B -D葡萄糖苷（2，3，5，4-tetrahydroxy-stilbene-2-glycoside,二苯乙烯苷，TSG） 能减少B -淀粉样肽诱导的老年斑沉积，改善痴呆模型大鼠学习记忆能力，降低淀粉样前体 蛋白（APP）的表达水平。我们通过观察APP695V717I转基因鼠的行为学表现及自噬相关蛋白 Beclin-1、LC3- U在海马的表达情况并探讨其意义，进一步揭示AD新的发病机制，以及何首乌提取物二苯乙烯苷治疗AD的主要作用

6、机制及药物靶点。材料和方法一、材料1. 实验动物分组及干预 ：10 月龄 APP695V717I 转基因小鼠 40 只，雌雄各半 （许可证号 01-3001），及20只年龄匹配的同背景 C57BL/6J小鼠，雌雄各半（作为正常对照），均购自中 国医学科学院实验动物研究中心。转基因小鼠随机数字表法分为 TSG组、模型组，各20只。 药物组给予 TSG 灌胃 1 个月，每天 1 次，灌胃量按 5 ml/kg 计算。正常对照组给予生理盐 水灌胃。2. 主要试剂和药物：Beclin-1和LC3- U抗购于Stressge公司；引物自行设计，由上海华大基 因有限公司合成；Trizol、Taq酶、逆转录酶

7、购自MBI公司。二苯乙烯苷为从何首乌中提取分 离的干粉，含量为68% (湖南中医药研究所提供)，实验时用水溶解为100 mg/kg的浓缩液。二、方法删掉“大鼠模型的建立、取材及干预”1.行为学检测：(1)Y电迷宫电击实验：电击次数表示其学习记忆的获得能力，记录每只大鼠 学会逃避电刺激次数，以30次为最大值计数。(2)Morris水迷宫定位航行实验(PNT ):每天 08 :00-11:00之间对每只大鼠进行训练,不选平台所在象限作为入水点,按顺时针方向把大鼠 面向池壁放入水中，检测大鼠隐匿平台潜伏期。如果在规定的最长时间 120s内未到达平台， 则由实验者将其引至平台,逃避潜伏期记为120s,

8、大鼠在平台休息20s后进行下一次测试。观 察并记录动物找到并爬上平台的潜伏期、游泳路程及游泳轨迹。3d训练结束后将大鼠按组别进行造模。于制模后21 d进行PNT0( 3)Morris水迷宫空间探索试验(SPT):各组大鼠最 后一次PNT后撤除平台，将大鼠从最后1次入水点面向池壁放入水中，使大鼠在水迷宫中连 续游泳，记录大鼠120 s内穿越原平台平面的次数。2 超微结构检测：分离海马组织后，磷酸盐缓冲夜(PBS)洗涤2次，4%戊二醛固定，冷 却后切块，2%锇酸固定，梯度丙酮脱水，浸泡，包埋，醋酸双氧铀 -柠檬酸铅双重染色，透 射电镜观察。3. 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测mRNA表达：依

9、据Medline基因文库自行设计引物，目 的基因 Beclin-1 (162 bp),上游弓I物：5' CCCTACAGGATGGATGTGGAGAAAG-3 '，下游弓I 物: 5' ATTGTGAGGACACCCAAGCAAGACC-3 ' 目的基因 LC3- II (136 bp),上游弓I物： 5' ACCAAGCCTTCTTCCTCC-3 ' 下游弓I物：5' TGTCCCGAATGTCTCCTG3-3 内参照 B -actin( 100 bp)，上游引物：5'-CGTTGACATCCGTAAAGACCTCTA-3下游引

10、物：5'TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3 '。产物经琼脂糖凝胶电泳，于紫外投射灯下观察 结果并拍照。4免疫印迹法(Western blot)测蛋白表达：密度梯度离心法提取蛋白，将海马组织转移到匀 浆器中，加裂解液匀浆，离心10 min (2400 r/min,半径13.5cm),取上清，继续离心15 min(转速 12000 r/min,半径 13.5cm),取上清，再离心 30 min (15 000 r/min,半径 13.5cm),加 入裂解液和蛋白酶抑制剂，用二奎琳甲酸(BCA)蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度；样品与 等体积的上样缓冲液混匀，煮沸变性

11、，用 10%十二烷基硫酸钠聚-丙烯酰胺凝胶电泳(SDS- PAGE)分离，转移蛋白至硝酸纤维素膜，5 %脱脂奶粉封闭，与一抗孵育，加入辣根过氧化 物酶标记二抗孵育，ECL试剂盒进行化学发光检测，JS-300凝胶图像仪扫描分析处理。三、统计学方法数据用SPSS12.0软件处理。计量资料用x s表示，两组间比较用t检验，多组独立样 本比较用方差分析。结果删掉“模型组大鼠脑组织切片染色结果”一、丫电迷宫检测与对照组比较，模型组躲避电刺激数明显增加(t =10.0884, P < 0.01),药物组躲避电刺激数增加(t =2.7781, P < 0.05),差异有统计学意义；与模型组比较，

12、经 TSG干预，药 物组学会躲避所需的电刺激显著减少(t =11.1755, P < 0.01),差异有统计学意义(表1)o二、Morris水迷宫检测与对照组相比，模型组和药物组小鼠的 Morris水迷宫测试游泳潜伏期(t =14.4648, P < 0.01)及路程均增加(t =5.6550, P < 0.01),穿越平台次数下降明显(t =15.5895, P < 0.01), 差别随时间的延长而加大；与模型组比较，药物组的潜伏期缩短(t =5.5023, P < 0.01),游泳路程缩短(t =2.2341, P < 0.05)，穿越平台次数增加(t

13、=4.8163, P < 0.01),差异具有统计学意义。见表1表1大鼠水迷宫行为学比较比较（xs）组别n潜伏期测试（秒）路程测试（米）穿越平台测试（次）对照组2017.03 ± 1.233.96 ± 1.0518.13 ±4.15模型组2032.15 ± 4.51 a8.30 ± 3.02 a3.09 ± 1.18 a药物组2025.26 ± 3.76 a b6.08 ± 3.26 a c4.82 ± 1.09 a c注：与对照组比较：a Pv 0.05;与模型组比较：cP V 0.05三、大鼠海

14、马CA1区电镜下自噬现象对照组：神经细胞胞膜完整，胞浆基质电子密度均匀，胞浆内线粒体结构清晰可见，细胞质 内线粒体及粗面内质网丰富，结构大致正常，线粒体嵴清楚、完整，核圆、核膜完整清晰， 高尔基体无改变。模型组：胞浆内线粒体结构欠清楚，嵴消失，少数呈空泡样变，粗面内质网结构欠清晰，部 分扩张，核膜较模糊不清，高尔基体大致正常，见图 2;胞内可见大量自嗜泡形成，见图3 药物组：胞浆内线粒体结构尚清楚，少数可见嵴消失，空泡样变很少见，粗面内质网结构尚 清晰，少数见轻度扩张，偶见个别胞浆水肿，核膜尚完整，高尔基体正常，见图4。图2电镜X 6000倍图3电镜X 6000 倍图4电镜X 6000倍四、自

15、噬相关蛋白 Beclin-1、LC3- U的mRNA及蛋白表达如图5/6/7所示，将RT-PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳并采用蛋白质印迹方法分析， 可见模型组的Beclin-1、LC3- n mRNA与其蛋白的表达趋势一致，与对照组比较，差异有统 计学意义（P=0.00<0.05）; TSG组在Beclin-1、LC3- n蛋白表达明显降低，与模型组比较有显 著性差异（P=0.00<0.05）;假手术组与对照组比较无显著性差异（P=0.2041>0.05）,排除手术因 素干扰。见图&表2大鼠Beclin-1、LC3- n的mRNA及蛋白相对表达（X s,%）组别

16、例数mRNA的相对表达蛋白的相对表达（%）Becli n-1LC3- nBecli n-1LC3- n对照组200.25 ± 0.010.23 ± 0.030.20 ± 0.01 0.26± 0.02模型组20a0.58 ± 0.01a0.42 ± 0.01a0.63 ± 0.01a0.52 ± 0.01药物组20,a b0.41 ± 0.02,ab0.34 ± 0.01,ab0.49 ± 0.02,a b0.36 ± 0.02ab注：与对照组比较：PV 0.05;与模型组比

17、较：Pv 0.05;ABCDABCD图 5: Beclin-1/ B -actin 的 mRNA 表达图6: LC3- n / B -actin 的 mRNA 表达A:对照组B:药物组C:模型组A:对照组B:药物组 C:模型组图 7: Beclin-1、LC3- n / B -actin 的蛋白表达A:对照组B:药物组C:模型组老年斑是阿尔茨海默病(Alzheimer ',AD)的主要组织病理变化，而B -淀粉样肽(B -amyloid, A B)是老年斑的主要成分，因此，A B的神经毒性是AD形成和发展的关键因素。A B由3943个氨基酸组成，来源于淀粉样前体蛋白(Amyloid p

18、recursor protein,APP),如果 各种危险因素导致APP的异常剪切，A B的空间构象发生改变，就会导致 A B异常聚集而产 生神经毒性作用4。正常情况下A B的空间二级结构以a螺旋为主，聚集性较弱，可被蛋白 酶水解；如果A B构象发生错误折叠，转变为B折叠时，聚集性较弱，不易被蛋白酶水解， 进而形成组织沉淀并诱导神经元凋亡。因此，在分子水平上，AD勺疾病本质是一种神经变性构象病，一种蛋白错误折叠并聚集的“蛋白构象病”。蛋白构象病的相同点是异常蛋白在 细胞内蓄积，而这些蛋白主要是依赖自噬途径被降解，提示自噬障碍可能参与了神经退行性疾病的发病。自噬溶酶体途径可能通过清除细胞内产生的

19、细胞毒性物质、失活的细胞器，再 循环利用细胞中的氨基酸、核普酸等成分，减少对细胞的损害，从而有利于挽救濒临死亡的 细胞。LC3和Beclin-1是参与自噬体形成的特异性的重要基因5。LC3- n定位于前自噬体和自噬 体，使之成为自噬体的标志分子。 一旦自噬体与溶酶体融合，自噬体内的LC3- n即被溶酶体 中的水解酶降解。LC3- n含量的多少与自噬泡数量的多少成正比，可通过检测细胞内LC3-n的含量变化，来判断细胞状态，判断其自噬是被诱导还是被抑制。而Becli n-1还是参与自噬调控的重要基因，它可以通过提高细胞自噬来抑制肿瘤的生长，是候选的肿瘤抑制基因，其不仅与自噬调控通路有关，而且涉及细

20、胞凋亡的调控，可能同时参与两种程序性细胞死亡 过程。因此，本研究用LC3- n和Beclin-1作为细胞发生自吞噬的标志分子。在实验中，Western® RT-PCR的结果显示，转基因小鼠的模型组海马部位 LC3、Beclin-1 的mRNA及蛋白表达均明显增高，说明APP转基因小鼠产生的A B启动自噬通路；推测A B在 形成纤维化的过程中产生的神经毒性可导致内质网功能障碍，细胞通过内质网自稳系统的调节，促进细胞内自噬来平衡应激状态。也有观点认为自噬溶酶体途径是产生毒性 A B的一个重要过程。在体内和体外试验中， Yu等和LeBlanc等9发现在自噬体内存在 A B,其前体B CTF

21、、APP及丫分泌酶。用 rapamycin或去血清等方法来增强自噬功能后，丫分泌酶能从内质网中转移至自噬体中，而A B的产生也大大增加。Haass等10研究发现细胞内A B对细胞的损伤远远大于细胞外 A B 的作用。此外，通过自噬溶酶体途径产生的 A B,可以通过溶酶体降解，也可以被分泌到细 胞外形成不可溶的异常聚集体。这些提示自噬溶酶体途径障碍可能导致毒性A B的产生增多，导致神经元的损伤和细胞外老年斑的形成。在前期的实验中我们发现 A B诱发的内质网应激及相关的凋亡通路参与A B神经毒性对脑的神经元损伤机理11。而目前的研究也发现内质网应激时 PERK信号通路促使某些蛋白 质如多聚谷氨酰胺

22、 polyQ72 在内质网中大量堆积，抑制内质网相关降解系统；同时磷酸化 elF2a,上调 Atg12(autophagy protein12形成 Atg5-Atg12-Atg16 复合物，引起 LC3 蛋白质的 膜转位诱发自噬12。结合本实验结果并回顾文献，我们认为在 AD的发病中，当A B被细胞 分泌至细胞外，形成纤维化的过程中，所表现的神经毒性开始起作用，AB可破坏细胞膜诱发氧化应激， 氧化应激又会破坏内质网功能， 引起的内质网应激在短时间内通过启动未折叠 蛋白保护通路如 PERK 等来保护对大脑造成的损伤， 同时内质网的应激也使细胞内产生的蛋 白在内质网中错误折叠的几率增加， 导致了错

23、误蛋白的异常剪切和积聚， 这些异常剪切的蛋 白可启动细胞的 LC3、Beclin-1 自噬通路，但当自噬无法降解过多的蛋白质时，这部分细胞 可能因为这种过度的应激导致通过特异性的内质网Caspase12凋亡途径发生死亡。因此可见，分泌至细胞外的A B可诱导细胞内产生更多的异常剪切和积聚的蛋白，这些错误折叠的蛋白即可诱发内质网介导的凋亡， 也可以通过自噬途径使细胞程序性死亡， 出现 AD 的病理学改 变及进行性加重的行为学障碍。对中药何首乌的相关研究表明， 何首乌能改善 AD 模型大鼠学习记忆能力， 对胆碱能神 经投射纤维有保护作用，可提高乙酰胆碱酯酶活性，可通过调节凋亡相关基因 Bax /Bc

24、l-2 通 路抑制细胞凋亡 13-16。因此，对何首乌的主要有效成分二苯乙烯苷进行研究，进一步揭示其 治疗 AD 的主要作用机理及药物靶点。在Morris水迷宫实验中，PNT主要考察大鼠的空间分辨学习能力，SPT主要测量大鼠的 工作记忆能力，通过本实验可以看出，在A B毒性作用下，转基因鼠的学习记忆、空间定向、 工作记忆能力明显下降 , 表现为 Y 电迷宫躲避所需的电刺激次数增加， Morris 水迷宫测试 中潜伏期延长，游泳路程增加及穿越平台次数减少；从时间上来看，这种损害随着A B暴露时间的延长而加重，说明AB对小鼠的学习记忆、空间记忆及工作记忆的损害呈逐渐增强的 累加效应；经 TSG 干

25、预后，小鼠躲潜伏期缩短 , 游泳路程缩短，穿越平台次数增加，说明 TSG 可改善模型小鼠学习记忆、空间定向、工作学习能力，具有脑保护作用。Western 和RT-PCR的结果显示，药物组经TSG干预后，海马部位LC3、Beclin-1的mRNA及蛋白表达 均降低。有研究提示TSG可以下调APP的表达，我们的前期实验证实TSG可以缓解内质网应激 程度，减少内质网应激分子伴侣 GRP78的表达和Caspase12诱导的凋亡11。因此，中药何 首乌提取物 TSG 可以明显改善 AD 鼠的学习记忆、空间定向等行为学功能，其作用机制可 能通过抑制淀粉样前体蛋白的表达， 减轻A B的神经毒性对内质网功能的

26、损害， 缓解内质网 应激程度，从而使自嗜通路中 Beclin-1、LC3- U的表达下调，细胞的自嗜和凋亡等减少，从 而起到改善 AD 鼠行为学障碍的脑保护作用。参考文献1 Querfurth HW,LaFerla FM.Alzheimer's disease.N Engl J Med.2010; 362(4):329-344.2 Komatsu M,Waguri S,Chiba T,et al.Loss of autophagy in the central nervous system causes neurodegeneration in mice.Nature,2006,441

27、:880-8843 Hara T,Nakamura K,Matsui M,et al.Suppression of basal autophagy in neural cell scausesn eurodege nerative disease in mice.Nature,2006;441:885-8894 Tomiyama T.lnvolvement of beta-amyloid in the etiology of Alzheimer's disease.Brain Nerve, 2010, 62(7) :691-6995 Vellai T.Autophagy genes a

28、nd agi ng.Cell Death Differ, 2009,16:94-102.6 Hua ng J, Klio nsky DJ. Autophagy and human disease. Cell Cycle, 2007,6(15):1837-18497 Aita VM,Lia ng XH,Murty VV,et a1.Clo ning and geno mic orga ni zati on of becli n 1,a can didate tumor suppressor gene on chromosome 17q21.Genomics,1999,59(1):59-65 .8 Yu WH,Kumar A,Peterhoff C,et al.Autophagic vacuoles are enriched inamyloidprecursorprotein-secret aseactivities:implications for beta-amyloid peptide over-production and localization in Alz