空肠弯曲菌致周围性自身免疫性周围神经病的实验研究

1、DOC格式论文，方便您的复制修改删减空肠弯曲菌致周围性自身免疫性周围神经病的实验研究(作者：单位：邮编：)作者：向淑利袁平李经伦胡先武【摘要】目的建立发病率高、具有典型临床表现的空肠弯曲菌(CJ)相关的轴索性自身免疫性周围神经病的动物模型。方法将Wistar大鼠随机分成三组：I组以CJ脂多糖(CJLPS、II组以CJLPS和锁眼形喊血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin,KLH)、皿组以KLH免疫，进行临床表现观察和坐骨神经病理学检查。结果I组和皿组中没有动物临床发病。II组中60%(6/10)的动物出现了肌肉无力表现。病理学检查I组神经原纤维异常率14.3%(57/400)

2、,II组神经原纤维率达17.3%(69/400),均明显高于皿组(X2=44.815,P0.01;X2=58.394,P0.01)0I组与II组的病变主要表现为轴索变性，二者病变的发生率差异没有统计学意义。结论以CJLPS+KLHfe疫大鼠诱发出了发病率较高、具有典型临床表现的CJ相关的轴索性自身免疫性周围神经病的动物模型。【关键词】弯曲菌空肠周围神经病动物模型AbstractObjectiveToconstructananimalmodelbyDOC格式论文，方便您的复制修改删减immunizationwithCampylobacterjejunilipopolysaccharide(CJL

3、PS)andkeyholelimpethemocyanin(KLH).Methods30Wistarratswererandomlydividedintothreegroups.GroupI,groupII,andgroup皿wereimmunizedwithCJLPS,CJLPS+KLHandKLHrespectively.Clinicalpresentationsandpathologicalchangeswereobserved.ResultsWeaknessappearedin6/10ofgroupI.NoneofgroupIandgroup皿showedweakness.Teased

4、fibersstudyrevealedthattheincideneeofpathologicalfibersofsciaticnervesingroup1(14.3%)andingroupI(17.3%)washigherthangroup皿(X2=44.815,P0.01andX2=58.394,P0.01respectively);therewasnodiffereneebetweengroupIandgroupHR.TransversesectionsofsciaticnervesshowedaxonaldegenerationingroupIandgroup皿.Conclusions

5、AnanimalmodelofaxonalperipheralneuropathyassociatedwithCampylobacterjejunicouldbeconstructedbyimmunizationwithCJLPSandKLH.KeywordsCampylobacterjejunianimalmodelperipheralneuropathy自身免疫性周围神经病即格林一巴利综合征(Guillain-Barresyndrome,GBS)分布全球，自脊髓灰质炎在世界大部分地区消灭以来，已成为最常见的周围性神经病。我国和日本等国家的GBS主要为DOC格式论文，方便您的复制修改删减轴索

6、型即轴索性自身免疫性周围神经病(axonalGBS)。GBS在我国农村多见，夏秋季节为发病高峰。总体来说CJ致GBS的发病机理尚不十分清楚，分子模拟是一个重要的学说。该学说认为CJLPS(lipopolysaccharide，脂多糖)与人神经节昔脂尤其是GM1GD1a和GQ1b之间存在分子模拟现象，CJLPS与人周围神经组织中神经节昔脂拥有共同的表位，机体产生的抗_LPS抗体与神经节昔脂结合发生交叉反应，激活补体等，产生病变1。然而以CJLPS免疫动物虽然诱发出了轴索型病理改变的GBS动物模型，但临床发病率低2,3o本研究以CJLPS和锁眼形喊血蓝蛋白(keyholelimpethemocya

7、nin,KLH)免疫大鼠，诱发出发病率高、具有典型临床表现的动物模型，为研究该疾病提供重要工具。1 材料与方法1.1 材料菌株CJ0:19,系从1例GBS患者分离获得，购自北京医科大学第一附属医院临床病毒室。Wistar大鼠。KLH购自美国Sigm公司以PBS溶解。将CJ血清型0:19冻存菌种复苏，划线接种于Camp-BA培养基上，42c微环境(5%0210%C0285%N2中培养48小时后，收集菌体或者继续传代培养。1.2 CJO:19LPS提取4采用热酚-水法，经RNA酶彳DNA酶I和蛋白酶K处理，低温超速离心纯化，经SDS-PAG电泳和银氨染色。1.3 CJLPS免疫大鼠60只6-8周龄

8、的雄性健康大鼠，随机被分成三组：1组、H组和皿组，每组各20只。I组，纯化LPS5001g作为免疫原，按每次500Jg/只LPS（以PBS稀释）注射于背部皮下。H组贝RI以500JgLPS+200AgKLH,皿组，200JgKLH为免疫原。每组动物免疫共5次，相互间隔7d,每次共40011,各组免疫初次加等量完全弗氏佐剂，以后加不完全弗氏佐剂充分乳化。初次免疫后第8w或者出现临床症状后3d,分别以多聚甲醛和戊二醛体内灌流固定，取坐骨神经，进行病理学检查。1.4 大便培养CJ按Pei等5的方法，连续监测大便，免疫前、表现肌无力后或者初次免疫后第8w取4-5粒新鲜大便用无菌PBS制成5%的悬液，0

9、.05ml大便匀浆涂布到CJ选择性的Camp-BAP培养平板上，42c微氧环境中孵育5d。对生长的菌落进行形态学和氧化酶反应鉴定。1.5 CJLPS全身性免疫后大鼠坐骨神经组织病理学检查初次免疫后第8w或者出现临床症状后3d,分别以多聚甲醛和戊二醛体内灌流固定，取坐骨神经，进行病理学检查，包括：（1）原纤维分离；（2）半薄切片光镜观察：高倍镜下观察有无原纤维丧失'轴索变性'髓鞘脱失'间质水肿和炎性细胞浸润。凡有上述一项病理改变且分布范围超过神经束横切面积1/2者，视为显著异常；不及1/2或散在性纤维病变者为轻度异常。1.6 统计学处理采用SPSS11.5统计软件，对计数

10、资料进行X2检验。2.1 CJLPS的鉴定电泳后的LPS经银氨染色，出现理想的LPS条'rfj'o2.2 临床观察I组和皿组中没有动物表现出肢体无力或者共济失调。II组10中有6只在初次免疫后第35-53天之间出现了无力表现。所有实验动物没有出现意外死亡。2.3 大便培养CJ免疫前、表现肌无力后或者初次免疫后8w大便培养CJ均为阴性。表明在实验前及实验中动物均没有发生CJ感染。2.4 CJLPS全身性免疫后坐骨神经原纤维的总病变率分别检测各组400根神经原纤维(10只大鼠)，I组(LPS免疫组)神经原纤维异常率达14.3%(57/400),其中65.0%为轴索变性。LPS免疫组

11、异常原纤维发生率明显高于对照组(1.5%,6/400,X2=44.815,P0.01),说明LPS存在明显致免疫性周围神经损伤危险。H组原纤维异常率达17.3%(69/400),其中63.0%为轴索变性。H组原纤维异常率明显高于皿组(X2=58.394,P0.01),但H组原纤维异常率和I组的差异没有统计学意义(X2=1.357,P0.05)o2.5 CJLPS全身免疫后坐骨神经半薄切片光镜观察I组有60%(12/20)的切片异常，其中67%(8/12)为轻度异常，33%(4/12)为显著异常，主要表现为不同程度的轴索变性及原纤维丢失。"组75%(15/20)的切片异常，其中47%(

12、7/15)为轻度异常，53%(8/15)为显著异。而皿组仅出现10%(2/20)切片轻度异常，表现为轴索变性及神经原纤维丢失。3讨论自身免疫性周围神经病即格林一巴利综合征(Guillain-Barresyndrome,GBS已成为最常见的周围性神经病。根据神经电生理学和病理学将自身免疫性周围神经病分为两种类型：一为脱髓鞘型即急性炎症性脱髓鞘性周围神经病(Acuteinflammatorydemyelinatingpolyneuropathy,AIDP)二为轴索型即轴索性自身免疫性周围神经病(axonalGBS)。目前GBS确切病因不明，流行病学资料显示，发病可能与空肠弯曲菌(C.jejuni,

13、CJ)、EB病毒、巨细胞病毒、肺炎支原体等感染相关。其中，CJ是最重要的前驱感染原之一，国外高达50%国内高达76%患者病前有CJ感染的证据。CJ致GBS比其他病原体相关的GBS更为严重，1/2的患者功能恢复不良，因而更受到学者们的广泛重视和研究。总体来说CJ致GBS的发病机理尚不十分清楚。但国内外大多数学者都倾向于分子模拟学说。良好的疾病动物模型是研究相应疾病发生机理和治疗的重要工具。虽然已成功地用髓鞘蛋白或其成分诱发出了动物模型即EAN(experimentalallergicneuritis,实验性过敏性神经炎)。近年，又有学者用神经节昔脂GM1免疫兔诱发出了轴索型自身免疫性周围神经病的

14、动物模型。然而，国内外尚无用CJ菌体成分诱发出发病率高、具有典型临床表现的CJ致GBS理想的动物模型的报道。CJ李春岩等用轴索型自身免疫性周围神经病患者分离出来的LPS加上弗氏佐剂作为免疫佐剂虽然也诱发出CJ致自身免疫性周围神经病，但发病率低，仅约百分之十几(1/8,3/26)2,3°KLHkeyholelimpethemocyanin,锁眼形喊血蓝蛋白)是从一种福洋最体动物血淋巴液提取高分子量的蛋白质抗原，是一种体内强有力的非特异性的免疫增强剂，既能诱导体液免疫又能诱导细胞免疫。由于它含有碳水化合物表位Gal(beta1-3)GalNAc,因此它常作为神经节昔脂类的佐剂使用,例如G

15、M2-KL治疗膀胱癌。国外已有KLH应用在神经节昔脂或者LPS的免疫模型，尤其是CJLPS与KLH和弗氏佐剂联合免疫新西兰大白兔成功建立GBS动物模型6,但还没有用此来免疫大鼠的报道。本研究提取自GBS患者分离的CJLPS,与KLH和弗氏佐剂一起免疫大鼠，诱发出发生率较高的临床症状，坐骨神经的组织病理学检查显示了轴索变性的重要病理改变，为探讨轴索型GBS的发病机理以及进一步的特异性免疫治疗提供重要工具。参考文献1 YukiNHumangangliosidesandbacteriallipo-oligosaccharidesinthedevelopmentofautoimmuneneuropat

16、hiesJ.MethodsMolBiol.2010;600:51-65.2 李春岩，田文强，刘瑞春等.PEN019空肠弯曲菌的脂多糖致轴索型格林-巴利综合征动物模型研究J.中华物理医学杂志.1997；3(19)33-35.3王强，王虹蛟，林世和等.实验性轴索型格林-巴利综合征动物模型的建立J.中华医学杂志.2000；12(80):947-949.4 WestphalO,JannK.Bacteriallipopolysaccharides:extractionwithphenolwaterandfurtherapplicationsofthetechniqueJ.MethodsCarbohydrChem1965;5:883-880.5 PeiZ,BurucoaC,GrignonB,etal.MutationinthepeblAlocusofCampylobacterjejunireducesinteractionswithepithelialcel