热点实验：WB,IH,IF,ICC实验

1、【嘉美生物】即日起推岀WB, IH, ICC, IF实验服务优惠活动，细则如下：1、嘉美生物提供原装进口抗体。我实验室进行实验服务有若干年的历史，因此我们实验室存有大批的国外原装抗体；意味着 实验者不必要花更多的钱去购买国外昂贵(一般都会需要2000元以上)的一抗。2、嘉美生物免费提供二抗以及所有的与实验相关的后续试剂。3、嘉美生物免费提供 WE标本所需要的蛋白保护液。该蛋白保护液可以保护样品在4度下保存半个月而不至于蛋白有损失。4、实验委托者之需要提供样品，即可完成整个实验。A Hippocampusj_JCortes匚冃E* *2dlinE 4 CocteKtlk阳KliniWB实验服务案

2、例一抗目的蛋白分子量稀释度公司/货号二抗稀释度Goat Rock1 antibodyAbout 160 kD1:500SANTA SC-6055Rabbit Anti GoatIgG/HRP1:40,000Goat Rock2 antibodyAbout 160 kD1:500SANTA SC-1851Rabbit Anti GoatIgG/HRP1:40,000Mouse GAPDH antibodyabout 37 kD1:800SANTA,SC-365062Goat Anti mouseIgG/HRP1:80,000注：SDS-PAG凝胶浓度为12%阳性条带以Gel pro4.0版凝胶光

3、密度分析软件进行分析，测其IOD( integrated optical density )累积光密度参考值。Fig 1 :亠 GAP 叶1:34 警 总Lanes:Lane 1Lane 2Lane 3Lane 4Lane 5Lane 6Rows(IOD)(IOD)(IOD)(IOD)(IOD)(IOD)Rockl242.39337.97229.78233.16151.48205.53Rock2233.48219.11238.76191.61151.18203.66GAPDH160.18130.47141.06156.13147.77151.07样本编号253828232624wB操作规程一.

4、设备和试剂1 .设备电泳F电源Mini-PROTEAN3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPacBasic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323)电泳仪及附件Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301)电转仪及附件Mini Teans-Blot Elecreophoresis Transfer Cell (BIO-RAD,Catalog#170- 3930) NC膜PIERCE Catalog#8801

5、8 滤纸Whatma n, 3MM CHR2.试剂凝胶试剂(实验室常备)试剂名称厂家30%丙烯酰胺溶液SIGMATris-BaseSIGMA10%SDSSIGMA10%过硫酸铵SIGMATEMEDSIGMA Total protein Extractio nKit ，ProMab?美国，Cat. No : SJ-200501Renewable Buffer 膜再生液，ProMab?美国，Cat. No : SJ-200512天然膜蛋白抽提试剂盒 ProteoExtract? (M-PEK), MERC德国，Cat. No： 444810天然浆/核蛋白分离抽提试剂盒 NucBuster TM P

6、rotein Exaction Kit，MERCK?德国，Cat. No : 71183-3Bradford蛋白浓度测定试剂盒，嘉美生物 ？中国，Cat. No : BRAKIT细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒，嘉美生物 ？中国，Cat. No : P1001 细胞膜蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒，嘉美生物 ？中国，Cat. No : P1003 常用溶液及缓冲液A. 5瀏层胶所用溶液按总体积2.5ml :ddH2O 1.7ml30初烯酰胺溶液：0.42ml1.0mol/L Tris (PH=6.8): 0.315ml10%SDS 25ul10%S硫酸铵:25ulTEMED 3ulB 分离胶溶液配

7、方参考表10 m i1S- mi尢心 mis蛉 ml3也 mi40 mlSO ml6° i GtiHjO300 Aayfamdel.b MTns MCl Ifxa B> |g SDS 10%ilWB« temed8*» GdHjQ30° AayfarridaI 5 MTrs HC <pHB Si 10% SOS咋过班IS義 TEMEDI Or* GelHjO3£r Aayiwride1 5 M Tne; HCi X b .iqsosTtMED 怙3HjQ30" ACT/umdoI 5 M Tne H住 ipHe &

8、；i 10% SOSioflTEMEDHiO30% Act秋加泊悝I巾悄T呻HQ *勒10% SDS0也晦整tempo3 _u s 1 1& 2 _2 o o Un0 o 1 J733.Q Q9 o3 3 £5.7:ei>.:0.0040.0080.0t2oo ia oca0 02<1o 0BQ»4 4o,a自 K3CMQo.0.3J.32-.11 o o fi-4 2 2 0 0O.OC60.009Q.0120.01 b189 0 b 3-J.a 1 3 fl- 7 Q Q Q .4*2 3 5 5 53 32.0.Q1 94.01.73.313J.5

9、0050.10.050.10,皿Q.0Q45 590 8 I 15.5.H 口口98 民D.O.O.11 915 910013 310 0Q3203阿 2Q.016097 5 5 56.2Q.QQGB o 6 o o o12 0 o 5 3301 a- 7 o D o1,1£.3945.79.222.55.075mo12J1&j03C.0S5.07it28MJ盟751Q.Q吨ai010_205&030.405005015D.2SD.40500020.004G.oao0010 OW0血C. 电泳缓冲液，1L3g Tris-Base、14.4g甘氨酸、1g SDS加蒸馏水

10、至IL, pH应该在8.3左右。也可以制成10X的储存液， 在室温下长期保存。|D. 电泳转移缓冲液,1L3g Tris-Base、14.4g甘氨酸、甲醇200ml,加蒸馏水至1L,也可以制成10X的储存液，在湿温下长期保 存。E. 5 X样品缓冲液，10ml0.6ml 1mol/L 的 Tris-HCl (Ph6.8 )、5ml 50%的甘油、2ml 10%的 SDS 0.5ml 2-巯基乙醇、1ml 1%溴酚蓝，0.9ml的蒸馏水，可在4 'C保存数周，或在-20 'C保存数月。二抗稀释液用 1%BSA-PB(含 0.05%TWEEN2)稀释。常用 Secondary An

11、tibody :Rabbit Anti Goat IgG/HRP, 嘉美生物,SEH0103,(1:10,00040,000)Goat Anti Rabbit IgG/HRP (SCBT, Catalog# sc-2030,1:10,00040,000)Goat Anti Mouse lgG+A+M(H+L)/HRP, ZYMED, #62-64201(1:40,000100,000)Goat anti-rat IgG-HRP,SANTA, sc-2032(1:5 0001:10 000)二蛋白提取(根据样品及检测要求选取以下适当提取方法)A-1 .组织裂解提取总蛋白(采用 Total pro

12、tein Extraction Kit，ProMab, Cat. No : SJ-200501 )1) .用剪刀剪取约0.5mg组织，置于组织匀浆器中，加入 1ml总蛋白提取液，匀浆 5min20min直到组织 充分破碎，然后冰上放置1020min后，再匀浆5min20min,将匀浆液吸出放到1.5ml离心管中。2) .超声3次，每次3s。3) . 9000rpm，离心10min,取适量上清置于新的 1.5ml离心管中4) . -20 C 冻存。A-2 .组织裂解提取膜蛋白(采用天然膜蛋白抽提试剂盒ProteoExtract ? (M-PEK) ,MERCKCat. No： 444810)1)

13、 确定缓冲液充分融解，且被旋涡器充分混合。在抽提过程中缓冲液1和2保持在冰上并和蛋白酶抑制剂混合。|2) 以下组织的处理应当尽快转移到4 'C无菌器皿中，如结缔组织，脂肪血管等，最理想的组织应当切成2到3mm的碎块，然后转入一个装有2ml冰冷缓冲液的管中洗涤。3) 轻轻弹打试管几次冲散血细胞和其它松散物质。4) .组织碎块在100 x g 4 C条件下离心2分钟，小心移去上清液且保证没有沉淀丢失。5) 加入2毫升冰冷缓冲液洗涤，重复步骤3和4洗涤，在最后的洗涤步骤之后，小心完全地除去所有的缓冲液。6) .转移适当量的细碎切块(可能冰冻的)到一个预冷的匀浆器。(最好是一个玻璃或石英制品)

14、，向匀浆器中加入10ul蛋白酶抑制剂，并立即加入2毫升冷的缓冲液1萃取组织块。7) 小心地匀浆组织碎块，可以使用杵磨碎组织细块直到它们成为冰冷的混合体(例如 牛的肝脏需要10下)，尽可能使碎块看不见。需要的用杵磨的次数取决于组织的结构。如果需要提高效率，可以事先使用显微镜观察其结构。目的是为了得到单个细胞，而非对组织进行支离破碎。8) 尽可能完全地转移混合物到一支预冷的管中并在4C轻柔的摇动10分钟。推荐使用旋转式振动器可以避免细胞结团的形成。9) .在16,000 x g 和4 C 15 min条件下分离不能溶解的材料。10) 丢弃上清液(丰富的“可溶性”蛋白质，此蛋白溶液可用于内参检测)或

15、使用吸移管转移它到样品管，无需干扰底层细胞。切记分离所有液体。如果需要应当保留成数份冰冻以便以后分析。11) .放入5ul蛋白酶抑制剂到匀浆器中充分混匀，并立即加入1毫升冰冷缓冲液2萃取细胞团，使用吸移管仔细地完全地重悬细胞团。在30分钟4 C条件下轻柔的摇动。推荐一台旋转式振动器避免细胞团的形 成。12) .在16,000 x g 和4 C 15 min条件下 分离不能溶解的材料。13) 使用吸移管完全转移上层清液 (包括丰富的膜相关蛋白质)到样品管，无需吸入细胞残渣。A-3 .组织裂解分离提取浆/核蛋白(采用天然浆/核蛋白分离抽提试剂盒 NucBuster TMProtein Exacti

16、on Kit ，MERC，Cat. No : 71183-3)1) .使用前浆冷冻的 Protease Inhibitor Coctail Set 1溶于100ul灭菌水配成100 x体积，分装冻存于-20 度(13 X 107 细胞用 1ul/100 x ) o2) 所有蛋白体提取过程应在冰面上操作，保持蛋白的稳定性。3) .取约120mg适量的冻存组织置于 EP管中，加入液氮使用 EP管研磨杵快速研磨成粉末。4) .将适量粉末转移至预冷的1.5ml EP 管中，加入150ul NucBuster Reagent 1。5) 高速漩涡振动15S，冰面孵育5min，再次高速漩涡振动 15S。6)

17、 . 4 C，16000g 离心 5min。7) 移除上清液(为胞浆蛋白成分，可用于内参检测)，胞浆蛋白可以保存他用或者丢弃，再用500ul预冷的1 X PBS再洗一次去除多余的胞浆蛋白。8) 在絮状沉淀中加入1ul 100 x Protease Inhibitor Coctail1ul 100mM DTT75ul NucBuster Exaction Reagent 29) 高速漩涡振动15S,冰面孵育5min,再次高速漩涡振动15S。10) . 4C, 16000g离心 5min。11) .将上清液(核蛋白)转移至另一管，可立即使用或分装保存于-70C。B-1 .细胞裂解提取总蛋白(采用

18、Total protein Extraction Kit，ProMab, Cat. No： SJ-200501 )1) .细胞收集好，加入1ml总蛋白提取液，充分吹打,然后冰上放置1020minmin 后，再吹5min20min,将匀浆液吸出放到1.5ml离心管中。2) .超声3次，每次3s。3) . 9000rpm,离心10min,取适量上清置于新的1.5ml离心管中。4) . -20C冻存。B-2.细胞裂解提取膜蛋白(采用天然膜蛋白抽提试剂盒 ProteoExtract? (M-PEK), MERCJKCat. No : 444810)1) .确定缓冲液充分融解，且被旋涡器充分混合。在抽提

19、过程中缓冲液1和2保 持在冰上并和蛋白酶抑制剂混合。2) .将细胞收集好转入一个装有2ml冰冷缓冲液的管中洗涤。3) .轻轻弹打试管几次冲散血细胞和其它松散物质。4) .在100X g 4C条件下离心2分钟，小心移去上清液且保证没有沉淀丢失。5) .加入2毫升冰冷缓冲液洗涤，重复步骤3和4洗涤，在最后的洗涤步骤之后， 小心完全地除去所有的缓冲液。6) .向装有洗涤好的细胞的管中加入10ul蛋白酶抑制剂，并立即加入2毫升冷 的缓冲液1萃取细胞。7) .小心地吹打细胞，尽可能使细胞看不见。8) .尽可能完全地转移混合物到一支预冷的管中并在4 C轻柔的摇动10分钟。推荐使用旋转式振动器可以避免细胞结

20、团的形成。9) .在16,000 x g和4 C 15 min条件下分离不能溶解的材料。10) .丢弃上清液(丰富的“可溶性”蛋白质，此蛋白溶液 可用于内参检测)或使用吸移管转移它到样品管，无需干扰底层细胞。切记分离所有液体。如果需要应当保留成数份冰冻以便以后分析。11) .放入5ul蛋白酶抑制剂到管中充分混匀，并立即加入 1毫升冰冷缓冲液2萃取细胞团.，使用吸移管仔细地完全地重悬细胞团。在 30分钟 4 C条件下轻 柔的摇动。 推荐一台旋转式振动器避免细胞团的形成。12) .在16,000 x g和4C 15 min条件下 分离不能溶解的材料。13) .使用吸移管完全转移上层清液(包括丰富的

21、膜相关蛋白质)到样品管，无需 吸入细胞残渣。B-3 .细胞裂解分离提取浆/核蛋白(采用天然浆/核蛋白分离抽提试剂盒NucBuster TM Protein Exaction Kit , MERC,Cat. No : 71183-3)1) .使用前浆冷冻的 Protease Inhibitor Coctail Set 1溶于100ul灭菌水配成100 X体积，分装冻存于-20度(13 X 107细胞用1ul/100 X)。2) .所有蛋白体提取过程应在冰面上操作，保持蛋白的稳定性。3) .将细胞收集好在EP管中，加入液氮使用EP管研磨杵快速研磨成粉末。4) .将适量粉末转移至预冷的 1.5ml

22、EP管中，加入150ul NucBuster Reage nt 1。5) .高速漩涡振动15S,冰面孵育5min,再次高速漩涡振动15S。6）. 4C, 16000g离心 5min。7）.移除上清液（为胞浆蛋白成分，可用于内参检测），胞浆蛋白可以保存他用或 者丢弃，再用500ul预冷的1X PBS再洗一次去除多余的胞浆蛋白。8）.在絮状沉淀中加入1ul 100X Protease Inhibitor Coctail1ul 100mM DTT75ul NucBuster Exact ion Reage nt 29）.高速漩涡振动15S,冰面孵育5min,再次高速漩涡振动15S。10) . 4C，

23、16000g离心 5min。11）.将上清液（核蛋白）转移至另一管，可立即使用或分装保存于-70C。线粒体蛋白提取见附录1三. 蛋白浓度测定：由于采用内参照法校正，省略根据总蛋白浓度估算点样法。四. SDS-PAG电泳1）.将抗原（组织/细胞裂解液）样品体积：5X loading buffer体积=5: 1，混 匀，在100C加热三分钟以使蛋白质变性。2）.设计加样顺序，作好实验记录，按预定顺序加样。一般每个电泳道加样最大 体积为25卩l,每个电泳道上样的最低蛋白质量（每一条蛋白质条带）：0.1（考 马斯亮蓝染色）-2ng （银染色）,最高蛋白质量（蛋白质混合物）：20-40卩g。3）.把电泳

24、装置与电源连接好，将电压调至200V,电流应流向阳极，待溴酚蓝迁移到分离胶底部0.5cm处，关闭电源。4）.从电泳装置上卸下凝胶玻璃板，用去离子水冲洗干净。准备进行免疫印操作。五. 免疫印迹操作-转膜1）.将凝胶玻璃板置于盛有电泳转移缓冲液的容器中，浸泡15-20min.。2）.带上手套，裁剪好滤纸（Whatman,3MM CHR和电转膜，滤纸和膜大小为 83mX 75mm尽量避免污染滤纸和膜，将裁减好的滤纸和膜浸泡与电泳转移缓冲 液中，驱除留于膜上的气泡。3）.打开转移盒并放置浅盘中，用转移缓冲液将海绵垫完全浸透后将其放在转移 盒壁上，海绵上再放置一张浸湿的 Whatma n,3MMS纸。4

25、）.小心将凝胶放置于滤纸上，避免气泡（用转移缓冲液润湿并戴手套以转移缓 冲液润湿胶面，小心将电转膜放在胶面上，从凝胶的一边开始轻轻放下可避免气 泡，注意一定要戴手套或镊子接触膜）。5）.用去离子水清洗缓冲液槽，在缓冲液槽中放入搅拌子，将另一块海绵用转移 缓冲液浸透后放在凝胶-膜“三明治”上，关上转移盒并插入转移槽。6）.将冰盒装入缓冲液槽，注满4C预冷的转移缓冲液。7）.将整个装置放在磁力搅拌器上并开始搅拌， 连接好转移电极恒流300mA专移 70min。8）.电转完毕后，将电转膜置于5%勺脱脂奶粉（PBS配制）中封闭，37C2小时 或4°C过夜。六. 免疫检测一抗与靶蛋白的结合1)

26、 .封闭的膜用PBST漂洗2-3次。2) .将加样槽洗涤干净，用蒸馏水润洗，晾干，将膜用一次性手套覆盖好，按标 记和实验设计切下膜条(一般为 3mm宽左右)按顺序置于加样槽中，作好实验 记录，加入相应的一抗约1ml，注意保证膜的所有部分同溶液接触。3) .室温下于摇床孵育2h或4°C过夜。4) .弃去一抗，膜条仍置于加样槽，每个槽加 2-3 mIPBST,上摇床洗涤洗涤5-10min，换液，反复4次。酶标记二抗与一抗的结合1) .根据实验需要和设计选择合适的酶标二抗和稀释浓度(用含 0.5%脱脂奶粉 的PBS稀释)，每个加样槽中加入二抗1ml左右室温下于摇床孵育1h或4C过 夜，注意

27、保证膜的所有部分同溶液接触。2) .弃去二抗，膜条仍置于加样槽，每个槽加 2-3 mIPBST，上摇床洗涤洗涤5-10min，换液，反复4次。七. 化学发光将膜风干，贴在玻璃纸上，加底物，做化学发光，得到胶片。将背景较高的底片 片放入PIERCE公司X光片背景去除液中，观察到理想的结果时，终止反应，用 水清洗以去除不需要的背景。八. 根据实验要求可适当选择 Werstern Bolt 膜再生显色法(采用Renewable Buffer 膜再生液，ProMab Cat. No : SJ-200512)1) 在完成WB勺显色或化学发光检测后，将蛋白转印膜置1X PBS中漂洗5分钟。2) .弃去1X PBS加入适量的 WB!再生液，至少需把膜完全覆盖。在摇床上漂 洗 45min。3) .弃W0g再生液，加入1X PBS在摇床上漂洗5min后，弃去1X PBS重复3 次洗涤步骤