血安片质量标准研究

1、血安片质量标准研究                作者：冮海峰 胡跃兰 孟祥军【摘要】  目的：按新药审批标准为血安片制定质量标准。方法：以TLC法对血安片中棕榈子进行定性鉴别；以HPLC法测定血安片中没食子酸的含量。结果：试验采用薄层色谱法定性鉴别，色谱斑点清晰，分离度良好，阴性液无干扰；以HPLC法测定该片剂中没食子酸的含量，方法精密度、稳定性、重复性良好，回收率为97.28103.22%，&

2、#160;RSD为2.0%(n=9)。结论：本试验所确定的质量分析方法稳定可靠，能作为本片剂的质量控制标准。 【关键词】  血安片 质量标准 方法学研究    【Abstract】Object:formulate the quality standard for the Xue,an tablets according to the requirement by Evaluat

3、ion of Chinese Government。Methods:the qualitative identifying method by TLC was established for Zonglvzi and gallic acid was quantitatively determined by HPLC。Result shows:the spots on&

4、#160;the TLC are clear by the methods of qualitative identification by TLC,the resolution is well and have no negative sample interference。The method for determinating the con

5、tent of tablets by HPLC is suitable for the formulate of the quality standard with sufficient accuracy、stability and reappearance 。The recovery rate is 97.28 103.22 %,RSD 

6、;is 1.92% (n=9)。Conclusion:the qualitative and quantitative analytic methods are stable and reliable。    【Keyword】The Xue,an tablets   Quality Standard   Method Appraise 

7、   血安片是根据已有部颁标准的血安胶囊1改变剂型得到的中成药制剂。是由棕榈科植物棕榈子的干燥成熟果实经乙醇提取加工制成的片剂，属中药八类新药。本品应用于临床上具有止血、收敛、调经之功效，用于治疗月事不准、经血过量、崩漏、淋漓不止、产后恶露不尽等妇科出血症。为保证临床用药安全有效，严格控制此片剂的质量，特对处方中棕榈子2的定性、定量方法加以筛选和分析，从而确立稳定可靠的质量标准。    原血安胶囊标准1鉴别项下为显色反应，为TLC薄层鉴别。通过实验证明，鉴别现象明显，具有重现性，可以继续沿用。而对鉴别项进行试验的结果表明，此

8、标准鉴别项下的薄层条件未能使棕榈子中的原儿茶酸达到有效的分离。通过查阅相关资料，我们采用文献“复方丹参口服液中药质量标准”3中的鉴别项的展开剂条件对本品的鉴别项进行了试验，试验结果证明此展开剂能够满足原儿茶酸的分离要求，且棕榈子中的原儿茶醛在此条件下也能显色，但与其他组分的分离效果并不理想，所以我们对此展开剂进行了优化，将展开剂苯-醋酸乙酯-甲酸（80504）的比例更改为（70404），此条件可以使原儿茶酸、原儿茶醛同其他组分有效的分离，所以特增加了棕榈子中原儿茶醛的鉴别，显色现象明显。经上述试验，修订了棕榈子的薄层鉴别。    我们参照文献“复方珍珠口

9、疮颗粒中药质量标准”4中没食子酸含量测定法对本品中所含的没食子酸进行测定。试验结果表明，没食子酸峰与其他杂质峰能够有效分离，其方法能够满足控制本品含量的要求，故我们采用文献中的HPLC法，建立了高效液相色谱条件，测定制剂中没食子酸的含量，其方法简便、准确、专属性强。同时考虑到本品中没食子酸含量，我们将对照品与供试品的取样量进行了适当的调整。    1  实验资料    1.1  处方  棕榈子10000g。    1

10、.2  制法  将棕榈子粉碎成粗粉，用5倍量的95%乙醇浸泡20分钟，加热提取2小时，回收乙醇，滤过，滤液浓缩至相对密度1.201.22（60）的清膏，干燥，粉碎成细粉，加入适量的辅料，混匀，制成颗粒，干燥，压制成素片1000片，包薄膜衣，即得。    2  性状    本品为暗红色薄膜衣片；除去包衣后显棕红色，味涩。    3  薄层定性鉴别    本制剂

11、是由棕榈子经乙醇提取加工制成的薄膜衣片，片重0.55g，其中含原药粉0.5g，相当于原药材10g。除去包衣后显棕红色，味涩。本品化学成分明确，对具有的对照品重点进行了筛选，最后确立采用TLC法对棕榈子中原儿茶酸、原儿茶醛进行定性鉴别，试验条件与方法说明如下。    3.1  展开剂的选择    本实验先后采用氯仿-丙酮-甲醇-冰醋酸（7110.5）2（），氯仿-甲醇-水（1371）5（），氯仿-丙酮-甲醇-冰醋酸（720.50.5）6 （），苯-醋酸乙酯-甲酸（80504）3（）为展开

12、剂，在系统（）的条件下，供试溶液中原儿茶酸与相邻组分分离度良好，并分离出了原儿茶醛，但分离效果不明显。为了更好的达到分离的目的，对其展开剂比例进行了一定的调整，经过试验验证，苯-醋酸乙酯-甲酸（70404）的比例效果最优。本试验曾对苯进行了环己烷、正己烷等化学结构相似的试剂的替代试验，但实验效果不佳，故确立苯-醋酸乙酯-甲酸（70404）为展开剂，鉴别其成分原儿茶酸、原儿茶醛。    3.2  棕榈子的TLC法鉴别    仪器：薄层层析装置、烘箱。试剂：所用试剂为分析纯，薄层层析用硅胶G由青岛海

13、洋化工有限公司制造，为化学纯。薄层板：取硅胶G，按13比例加入水，铺成0.3mm厚的薄层板，晾干，105活化30分钟，干燥箱内保存。    本试验根据复方丹参口服溶液中药质量标准标准号：WS-150（Z-30）-92规定的方法检查方中棕榈子所含的原儿茶酸、原儿茶醛，经采用萃取法去除了部分干扰组分的影响，经多次试验，供试品色谱中，具有与对照品相同位置的相同颜色的斑点，待测组分斑点清晰，方法重复性良好，阴性液无干扰。    供试品及标准品的制备按照血安片标准，考虑到原胶囊内容物中未添加辅料，故标准应根据药物原粉与辅料的

14、比例适当增加供试品的取样量。具体操作方法：取本品12片，研细，取约5.5g，加水50ml，热浸2小时，滤过，滤液置分液漏斗中，用乙醚提取二次，每次20ml，合并乙醚层，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取原儿茶酸、原儿茶醛对照品，分别加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2005年版一部附录 B）试验，吸取上述三种溶液各20l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯-甲酸（70404）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，斑点久置加深。  

15、;  4  检查    照中国药典2005年版一部（附录D）7检查。    4.1  重量差异  照中国药典2005年版一部附录D的重量差异项下测定，重量差异限度应在标示装量的±5.0%以内，三批样品均符合规定，结果见表1。表1    重量差异的测定结果结果表明，三批样品重量差异均符合规定。    4.2  崩解时限 

16、 照崩解时限检查法（中国药典2000年版一部附录 A）测定样品，三批样品（20060304、20060305、20060306）的检查结果见表2。表2  崩解时限的检查结果结果表明，三批样品崩解时限均符合规定。    4.3  微生物限度  照微生物限度检查法（中国药典2005年版一部附录 C），细菌数限度为100个/g，霉菌、酵母菌数限度为100个/g，大肠杆菌、活螨不得检出。三批供试品（20060304、20060305、20060306）的检验结果，测定结果见

17、表3。表3  微生物限度检查结果结果表明，三批样品微生物限度检查均符合规定。    4.4  砷盐  按砷盐检查法（中国药典2005年版一部附录 F）试验。    精密量取每1ml含1g的标准砷溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml，置坩埚中，同供试品砷斑制备方法，依法制备标准确砷斑（依次为A、B、C）；取本品10片，研细，取约1g，精密称定，置坩埚中，缓缓灼烧至完全炭化，放冷，加硫酸1ml使湿润，用低温加热至硫酸除尽后，加硝酸0.5ml，蒸干，

18、至氧化氮蒸气除尽，放冷，在540灼烧使完全炭化，放冷，加水25ml，定量转移至A瓶中，加碘化钾试液5ml与酸性氯化亚硒试液5滴，在室温放置10分钟后，加锌片2g，立即连接导气管C与A瓶，置37水浴中，反应45分钟，取出溴化汞试纸，即得。依法测定三批样品（20060304、20060305、20060306），砷盐含量均低于2ppm，测定结果见表4。表4     砷盐检查结果试验结论：通过对三批样品的检验其砷盐含量均低于2ppm，因此暂不将其列入标准。    4.5  炽灼残渣 

19、; 按炽灼残渣检查法（中国药典2005年版一部附录 J）测定。取本品10片，研细，取约1g，置已炽灼至恒重的坩埚中，精密称定，缓缓炽灼至完全炭化，放冷至室温，加硫酸1ml，使湿润，低温加热至硫酸蒸汽除尽后，在540炽灼使完全灰化，移置干燥器内，放冷至室温，精密称定后再在540炽灼至恒重。测定三批供试品（20060304、20060305、20060306），炽灼残渣含量均低于0.2%，测定结果见表5。表5  炽灼残渣的测定结果试验结论：通过对三批样品的检验炽灼残渣含量均低于0.2%，因此暂不将其列入标准。    4

20、.6  重金属  按重金属检查法（中国药典2005年版一部附录 E第二法）测定。取炽灼残渣项下残渣，分别加硝酸0.5ml，蒸干，至氧化氮蒸汽除尽，放冷，加盐酸2ml，置水浴上蒸干后加水15ml，滴加氨试液至对酚酞指示液显中性，再加醋酸盐缓冲液（PH=3.5）2ml，微热使溶解，移置纳氏比色管中，加水稀释成25ml（乙管：1、2、3）；另取配制供试品溶液的试剂，共四份，分别置瓷皿中蒸干，各加醋酸盐缓冲液（PH=3.5）2ml与水15ml，微热使溶解，分别移置纳氏比色管中，分别加每1ml相当于10g的标准铅溶液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2

21、.0ml，加水稀释成25ml（甲管：1、2、3与4）。在甲乙两组管中，加硫代乙酰胺试液各2ml，摇匀，放置2分钟，同置白纸上，自上而下透视，比较甲管与乙管的颜色。结果：乙管1、2、3的颜色均比甲管2的颜色浅。三批供试品（20060304、20060305、20060306）中重金属含量均低于10ppm，测定结果见表6。表6   重金属测定结果试验结论：通过对三批样品的检验重金属含量均低于10ppm，因此暂不将其列入标准。    5  含量测定    本制剂由棕榈子经

22、提取加工制成，经参考有关文献表明棕榈子中含有原儿茶酸、原儿茶醛、对羟基苯甲酸、d-儿茶素、没食子酸等。现代药理学实验表明，没食子酸为棕榈子中主要的止血成分，具有抗凝血和血栓形成等生理活性，故本试验拟HPLC法测定没食子酸的含量，对控制本品的内在质量很有意义。在选定的色谱条件下，阴性液无干扰。经方法学考察，方法的线性、精密度、重现性、稳定性、最低检测限、定量限、阴性对照溶液试验、加样回收试验、样品的含量测定均符合有关规定。因此，确立本制剂定量指标为没食子酸，定量方法为液相色谱法。    5.1  仪器试药  

23、0; 仪器：高效液相色谱仪（UV200 大连依利特科学仪器有限公司）；SunRun Express色谱数据工作站；电子天平（AL204 梅特勒-托利多上海称重设备公司）；色谱柱：Diamonsil C18柱（205×4.6mm，5m）；试药：甲醇-0.1%磷酸水溶液（1585），甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯，没食子酸（供含量测定用，110831-200302），中国药品生物制品检定所。    5.2  色谱条件及系统适用性试验考察   

24、0;5.3  线性范围考察     精密称取没食子酸对照品12mg置100ml量瓶中，加20%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀。再分别精密量取0.8、0.9、1.0、1.1、1.2ml，置10ml量瓶中，加20%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1ml分别含9.6g、10.8g 、12g 、13.2g 、14.4g没食子酸的溶液。精密量取上述溶液各20l，分别注入液相色谱仪，测定峰面积，结果见表8。以峰面积（Y）对进样浓度（，g/ml）进行线性回归，回归方程为Y=99483x17969，相关系数R2=0.

25、9997。结果表明，注入液相色谱中的没食子酸质量在0.1920.288g范围内，峰面积与没食子酸浓度线性关系良好。分别精密吸取上述溶液各20l，注入液相色谱仪中，测定色谱峰面积，测定结果见表7。表7    线性范围考察结果以注入液相色谱中的没食子酸的量为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，经线性回归，回归方程为：Y=5E06x17969，R2=0.9997，由测定结果提示，注入液相色谱中的没食子酸质量在0.1920.288g范围内线性关系良好。    5.4  阴性干扰试验 &#

26、160;  5.5  供试品溶液制备方法考察    鉴于本制剂中棕榈子已经提取后加入，故本试验拟以超声处理法制备供试液。试验中对提取溶剂、超声处理条件进行了定量考察，考察结果如下。    5.6  精密度试验考察    5.7  稳定性试验考察    取本品5片（批号20060304）去包衣后研细，取细粉约1.3g，精密称定，按正文含量测定项下方法制备供试液

27、。精密量取同一供试液（批号20060304）20l，按0、2、4、6、8小时时间间隔，分别进样分析，测定色谱峰面积，测定结果见表12。表12  稳定性试验考察结果试验结果提示，供试液制备后8小时内测定，色谱峰面积无明显变化，在此时间内待测组分化学性质稳定。    5.8  最低检测限    取对照品溶液1ml，置100ml量瓶中，加20%甲醇稀释至刻度，摇匀，再精密量取20l注入液相色谱仪中，记录色谱图，按3倍信噪比S/N计，最低检测限为2.4ng。  &

28、#160; 5.9  定量限    取对照品溶液3ml，置100ml量瓶中，加20%甲醇稀释至刻度，摇匀，再精密量取20l注入液相色谱仪中，记录色谱图。色谱图中，信噪比约为101，计算定量限约为7.2ng。    5.10  加样回收试验考察    取没食子酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含12g的溶液，即得，作为对照品溶液。取本品5片，去包衣后研细，取细粉约1.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇15ml，称

29、重，超声处理（功率200W，频率40KHz）30分钟，取出，放冷，称重（补足原重量），摇匀，滤过，滤液经微孔滤膜（0.45m）滤过，溶液置棕色瓶中备用，即得，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液与对照品溶液各20l，分别注入液相色谱仪，测定，测得供试品中没食子酸的含量（C）为140.8g/g。取没食子酸12mg，置100ml容量瓶中，加20%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀；再精密量取10ml，置100ml容量瓶中，加20%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含没食子酸12g，作为加样用对照品溶液。取上述已经测定含量的供试品药粉，分别精密称定约0.9g、1.3g、1.7g各三份，精密称定，置具

30、塞锥形瓶中，精密加甲醇、加样用对照品溶液各15ml，称重，超声处理（功率200W，频率40KHz）30分钟，取出，放冷，称重（补足原重量），摇匀，滤过，滤液经微孔滤膜（0.45m）滤过，溶液置棕色瓶中备用，即得，作为加样用供试品溶液。精密量取上述各溶液20l，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定含量，计算加样回收率，测得9次平均回收率为99.80%，RSD为2.0%，结果见表13。测得量（mg）=A供/A对×C对×30（ml），样品中没食子酸含量（g）=供试品取样量×140.8（g/g）。表13      &

31、#160;     加样回收试验测定结果测定结果提示：本方法回收率在97.28103.22%之间，RSD为2.0%，符合有关规定。        根据上述试验结果，制定血安片的含量测定方法如下。色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1%磷酸水溶液（1585）为流动相，检测波长为273nm。理论板数按没食子酸峰计算应不低于2000。对照品溶液的制备：取没食子酸对照品适量，精密称定，加20%甲醇制成每1ml含12g的溶液，即得。供试品溶液

32、的制备：取本品5片，去包衣后研细，取细粉约1.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇15ml，称重，超声处理（功率200W，频率40KHz）30分钟，取出，放冷，称重（补足原重量），摇匀，滤过，滤液经微孔滤膜（0.45m）滤过，溶液置棕色瓶中备用，即得。测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20l，注入液相色谱仪，即得。    5.11  含量限度确定的试验    为制定含量限度标准，制备供试品十批（20060301、20060302、20060303、20060304、2006030

33、5、20060306、20060307、20060308、20060309、20060310），并与血安胶囊市售品（批号20060227）比较。按上述测定方法，测定样品中没食子酸的含量，结果见表14。表14    样品的测定结果本品的原药材棕榈子收载于卫生部药品标准中药材第一册（1992年版），其中没有对其有效成分没食子酸进行限量，而且查阅相关文献仍没有明确的规定。因此根据上述测定结果，考虑到药材的来源和质量差异对棕榈子回收率的影响，最后将其含量限度暂定为：本品每片含棕榈子以没食子酸（C7H6O5）计，不得少于50g。    6  讨论    6.1  本试验采用T