IFT74对雄性小鼠精子发生及生育能力的影响.doc

1、IFT74 对雄性小鼠精子发生及生育能力的影响目的 : 探讨鞭毛内转运蛋白74（IFT74）对雄性小鼠精子发生和生育能力的影响 , 为更加全面地了解男性生殖功能障碍提供一定的科学线索。方法 : 将成年的Ift74^flox/flox雌性小鼠与 Stra8-iCre雄性小鼠杂交 , 建立 Ift74基因条件敲除小鼠 , 通过常规 PCR分析小鼠的基因型 , 筛选出Stra8-iCre⁺/Ift74^flox/flox雄性小鼠作为实验组 ,Stra8-iCre<

2、;sup>-</sup> 雄性小鼠作为对照组 , 收集各组小鼠的心脏、 脑、脾、肺、肝、肾、肌肉、睾丸及附睾等组织 , 采用蛋白印迹法检测在对照组小鼠各组织中 IFT74 蛋白的表达水平及睾丸组织中第一波精子发生各个阶段IFT74 蛋白的表达水平 ; 采用免疫荧光染色检测IFT74 在实验组及对照组雄性小鼠睾丸组织生精细胞中的定位 ; 采用 HE染色检测睾丸和附睾等组织中精子发生各个阶段的形态学的变化 , 扫描电镜观察附睾中精子形态的变化, 透射电镜观察小鼠睾丸组织超微结构的改变 ; 蛋白印迹检测各组小鼠睾丸组织中IT20 、IFT25、IFT27、IFT81、IFT88 、

3、IFT140、ODF2、SPAG16L、AKAP4等精子发生相关蛋白表达水平的变化;并收集各组雄性小鼠附睾中的精子, 进行精子计数 , 检测精子活力 ; 同时选取 6 对6 周龄以上的 Ift74基因条件敲除雄性小鼠和对照组雄性小鼠分别与成年野生型雌性小鼠交配两个月以上, 评估其生育及繁殖能力。 结果 :IFT74 蛋白在雄性小鼠脑、肺、肾和睾丸等组织器官中均有表达, 且在睾丸组织中的表达量最高。在雄性小鼠出生后第一波精子发生的过程中,IFT74 蛋白从第 12 天开始有表达 , 到第 20 天其表达量显著上调 , 至第 35 天达到最高水平。 IFT74 蛋白主要定位于精母细胞和圆形精子细胞

4、的囊泡、延长精子细胞的顶体和中心体, 以及发育中的精子尾部。 HE染色结果发现对照组小鼠睾丸组织中的精子鞭毛被释放到管腔中 , 生殖细胞细胞质的残余体被支持细胞吞噬 , 精子发生过程正常 , 且附睾管腔内充满有着正常头部和尾部的精子 ; 但在 Ift74 基因条件敲除雄性小鼠睾丸组织中 ,第 VIII 阶段的精子形成异常 , 没有形成正常的残余体 , 细胞质保留在管腔边缘或脱落到管腔中 , 且第 16 期异常的精子细胞被吞噬 , 在第 XI 阶段观察到具有畸形的头部且无尾巴的异常第 11 期精子细胞 , 在第 XIII 阶段的生精小管内虽有正常的圆形精子细胞 , 但第 13 期的延长精子细胞尾

5、部缺失 , 同时过量的细胞质脱落到管腔中 , 且附睾管腔内几乎观察不到具有正常头部和尾部的精子 , 管腔内存在大量异常的细胞质残留体 , 脱落的圆形细胞 , 以及异常头部和短尾或无尾的异常精子细胞。扫描电镜结果显示对照组小鼠附睾中的精子均具有形状正常的头部和长而光滑的尾巴 , 而 Ift74 基因条件敲除雄性小鼠精子结构异常 , 出现圆头 , 短尾或无尾等改变 ; 透射电镜观察到对照组小鼠睾丸曲细精管的管腔内存在大量正常 “ 9+2”双微管结构的轴丝以及正常的头部 , 但 Ift74 基因条件敲除雄性小鼠睾丸曲细精管中精子的轴突和微管呈现多样性的异常 , 如无序的微管、无核心轴丝结构的微管和线粒体簇、 或者缺失中央微管而形成异常的轴丝等。 在 Ift74 基因条件敲除雄性小鼠睾丸组织中 ,IFT-B 复合物的其他成分如 IFT27,IFT57,IFT81,IFT88 和IFT140 以及纤维鞘的主要成分AKAP4表达水平显著低于对照组小鼠体内的表达水平 , 差异具有统计学意义（ P&lt;0.05 ）。且与对照组小鼠相比 ,Ift74基因条件敲除雄性小鼠的精子数量和精子活力显著降低, 且精子的运动能力也下降（ P&lt;0.05）, 虽然它们有正常的交配行为, 但完全不具备生育能力。结论 :IFT74 是雄性小鼠精