糖耐康颗粒对胰岛素抗击3T3–L1脂肪细胞炎症因子的阻碍

1、糖耐康颗粒对胰岛素抗击3T3-L1脂肪细胞炎症因子的阻碍牛洁刘铜华王志程杨丽霞【摘要】目的：探讨糖耐康颗粒对胰岛素抗击3T3-L1脂肪细胞炎症因子的阻碍。方式：通过地塞米松与胰岛素一起诱导3T3-L1脂肪细胞成立胰岛素抗击模型，检测中药糖耐康对细胞上清中TNF-a、IL-六、CRP水平的阻碍。结果：与正常组比较，模型组TXF-a、IL-六、CRP水平明显升高；经中药糖耐康和西药吐格列酮干与后，TNF-a、IL-六、CRP水平显著下降，与模型组比较有显著不同。结论：TXF-a、IL-六、CRP参与胰岛素抗击的发生，中药糖耐康可能通过降低炎症因子的水平发挥改善胰岛素抗击的作用。【关键词】糖耐康；3

2、T3-L1脂肪细胞；胰岛素抗击；炎症(Abstract)ObjectiveTostudytheeffectofTangnaikanggranuleoninflammatoryfactorofinsulin-resistant3T3-Lladiopocytes.MethodsAfterutilizingdexamethasoneandinsulintoestablishinsulin-resistantmodlebyinduced3T3-LIadipocyte,thelevelsoftumornecrosis-alpha(TNF-a),interleukin-6(IL-6)andC-reacti

3、veprotein(CRP)ofcellsupernatantweredetected.ResultsThelevelsofTNF-a,IL-6andCRPofmodelgroupweresignificantlyincreasedcomparedwiththoseofnormalinterventionofTangnaikangandPioglitazone,thelevelsofTXF-a,IL-6andCRPwereobviouslydecreasedcomparedwiththoseofmodelgroup.ConclusionTheinflammatoryfactorofTXF-a,

4、IL-6andCRPparticipatedtheformationofinsulinresistance,Tangnaikangcoulddegradetheinflammatoryfactorlevelstoimprovetheinsulinresistance.(KeyWords)Tangnaikang;3T3-LIadipocyte;InsulinResistance;Inflammation胰岛素抗击(InsulinResistance,IR)是2型糖尿病(Type2DiabetesMellitus,T2DM)发病中的要紧环节，其形成机制复杂,最近几年来研究提示IR是个慢性非特异性炎

5、症进程，慢性炎症参与了IR的发生与进展1。因此，干与炎症进程，改善IR将成为防治T2DM的新趋势。故本实验以炎症-IR为切入点，通过观看中药复方糖耐康对胰岛素抗击3T3-L1脂肪细胞中炎症因子水平的阻碍，为其防治IR及T2DM提供靠得住依据。1材料与方式要紧材料3T3-L1前脂肪细胞株购自ATCC；DMEM高糖培育基，新生牛血清均购自GIBCO公司；牛胰岛素，3-异丁基甲基黄喋吟（IBMX）,地塞米松（DEX）,油红“0”染剂均购自Sigma公司；葡萄糖检测试剂盒购自国药集团化学试剂北京；TNF-a抗体试剂盒，IL-6抗体试剂盒，CRP抗体试剂盒均购自美国RB公司。实验药品糖耐康颗粒（人参、夏

6、枯草、女贞子、番石榴叶、三白草组成）:9g/袋，由四川美大康佳乐药业生产提供；盐酸毗格列酮片（艾汀）:15mg/片，购自北京太洋药业。要紧仪器C02孵育箱：BB16/BB5060型，德国Heraeus公司；超净工作台：半导体设备一厂生产；台式高速冷冻离心机：ST-21型，美国索福公司；高压蒸汽消毒器：HVE-50型，日本HIRAYAMA公司；电热恒温培育箱：HHB11420型，天津实验仪器厂生产；低速自动平稳微量离心机：LDZ4-型，北京医用离心机厂生产；倒置显微镜：日本Nikon公司；酶标仪：MultiscanMK3型；实验耗材：美国COSTAR公司。方式3T3-L1前脂肪细胞诱导分化2将3

7、T3-L1前脂肪细胞置于含10%新生牛血清的DMEM高糖培育基中，37,5%C02饱和湿度下培育。细胞状态良好时接种于培育板，待细胞融合2d后，换用含10%新生牛血清、mmol/LIBMX>10Hg/mL胰岛素、Hmol/LDEX的DMEM高糖培育基（即诱导溶液1）培育48h,后换用含10%新生牛血清、10Ug/mL胰岛素（即诱导溶液2）再培育48h,随后以10%新生牛血清的DMEM高糖培育基继续培育，2d换1次培育液，诱导分化812d的3T3-L1前脂肪细胞90%以上可分化为成熟的脂肪细胞,进行油红“0”染色鉴定为脂肪细胞后，方可用于实验。脂肪细胞鉴定采纳油红“0”染色法，具体进程如下

8、：将诱导分化终止的脂肪细胞，先用PBS洗3次以除去培育基；中性甲醛固定10min,然后水洗,将细胞晾干20min；加入油红“0”染液染色30min（密封）；再用60%异丙醇冲洗，以除去多余的染料，然后水洗；加入苏木素复染细胞核2min,用水冲洗；稍干后以甘油明胶封固；在倒置显微镜下观看。3T3-L1胰岛素抗击细胞模型的成立3,4将成熟的3T3-L1脂肪细胞用含DEX1Umol/L>InsulinlOnmol/L及10%新生牛血清的DMEM培育基孵育96h,后取培育液上清，采纳葡萄糖氧化酶法，以培育基中的葡萄糖的消耗量反映胰岛素抗击情形，成立胰岛素抗击细胞模型。含药血清的制备健康雄性Wis

9、tar大鼠（购自北京维通利华实验动物技术）60只，体重230250g,适应性喂养2d后，随机分为空白组、中药糖耐康（TNK）组、西药毗格列酮（BG）组，依照人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值，换算不同药物灌胃剂量5,然后在等效剂量10倍基础上灌胃，空白组给予相同体积的生理盐水，TNK组按g/kg剂量灌胃（在等效剂量10倍基础上），BG组那么按mg/kg灌胃，持续给药5次，每日相同时刻别离给药2次，在第4次灌胃后禁食不由水12h后给予最后1次给药，lh后，10%水合氯醛腹腔麻醉，无菌条件下腹主动脉取血，常温静置2h后，低温离心3000r/minX20min,Um滤膜过滤除菌，用mL冻存管分装

10、（每支），一20保留备用。分组方式及给药分为7组，别离为正常脂肪细胞组、胰岛素抗击组、空白组、TXK低剂量组、TNK中剂量组、TNK高剂量组和BG组。其中，空白组给予对应血清浓度为%;TNK低、中、高剂量组组给予对应血清浓度别离为、%及16%；西药BG组给予血清浓度为九观看指标3T3-L1前脂肪细胞及诱导分化后的形态学观看；TNF-a、IL-六、CRP的ELISA检测：依照试剂盒说明书操作。统计方式采纳SPSS统计软件，计量资料用均数土标准差（）表示，计量资料两组间比较采纳t查验，多组比较，如方差齐时，可采纳单因素方差分析，如方差不齐时，可采纳非参数查验（秩变换分析方式）,P有统计学意义。2结

11、果3T3-口前脂肪细胞及诱导分化后的形态学3T3-L1前脂肪细胞呈梭形，胞浆中无脂滴，形态类似于成纤维细胞。诱导分化后，细胞慢慢变圆，胞浆中有脂滴，当分化到812d时，3T3-口前脂肪细胞90%以上可分化为成熟的脂肪细胞，表现为胞浆丰硕，含有大量的脂滴，脂滴散布于核周围，形成“戒环样”结构，为典型的成熟脂肪细胞形态，经油红染色后观看到脂滴着红色，细胞核着蓝色。各组含药血清对胰岛素抗击3T3-口细胞TNF-a、IL-六、CRP水平的阻碍见表1,图13。表1各组细胞上清中TXF-a、IL-六、CRP水平从表1及图13可看出，与正常脂肪细胞相较，IR细胞模型上清中TXF-a、IL-六、CRP水平明显

12、升高，统计学上有明显不同。与模型组比较，TNK各剂量组和BG组均有不同程度改善，其中，TXKM组、TNKH组和BG组改善最为明显。TNKH组可显著降低IR细胞上清中TNF-a的含量，与BG组比较有统计学不同。TNKM组可明显降低细胞上清中IL-6的水平，与BG组比较无统计学不同。与中药TXK各剂量组比较,BG组可明显降低细胞上清中CRP的水平,统计学上有显著不同。3讨论愈来愈多的研究说明炎症因子在T2DM及IR的发生中扮演着重要的角色，要紧包括TNF-a、CRP、IL-六、抗击素、瘦素等，这些炎症因子彼此联系、彼此作用，形成一个复杂的调控网络，启动炎症信号通路，从而干扰正常的胰岛素信号传导，最

13、终致使IR的发生。其中，TNF-a.CRP、IL-6与IR形成关系紧密。有报导称，在肥胖与IR的啮齿动物模型中，脂肪组织中的TNF-a水平是升高的，存在有TXF-a信号遗传缺点的小鼠或通过抗TNF-a免疫球蛋白来中和TNF-a都可改善胰岛素灵敏性6,70在IR的研究中，说明CRP水平与体重指数、空肚胰岛素及胰岛素原呈正相关，与胰岛素灵敏性呈负相关，说明CRP参与IR的发病进程8。在T2DM肥胖组中，存在着严峻的IR,IL-6水平是显著升高的，IL-6与胰岛素抗击指数、体重指数成正相关，经医治后，患者中胰岛素抗击指数、IL-6水平明显改善，一样说明IL-6参与了T2DM胰岛素抗击的发生90本实验

14、结果显示，IR细胞模型上清中TNF-a、IL-6及CRP的含量明显升高，证明三者参与IR的发生，这与之前报导是一致的。中药复方糖耐康是以“清热生津、益气养阴”为组方原那么，要紧由人参、女贞子、夏枯草、番石榴叶、三白草5味药组成，可明显降低血糖，改善IR,增加胰岛素灵敏性10,11。现代研究也说明，人参皂武可显著降低血糖和胰岛素水平，并通过降低血清中CRP、WP-9水平而改善T2DM及其并发症12-14。番石榴叶提取物有明显降低血糖及提高胰岛素灵敏性的作用15。本实验结果显示，中药糖耐康可明显降低IR细胞上清中TNF-a、IL-6及CRP的含量。其中，中药糖耐康高剂量组在降低TNF-a方面优于西

15、药毗格列酮；中剂量组在降低IL-6方面类似于西药毗格列酮。结合前期资料，推测中药糖耐康可通过降低炎症因子的水平来改善IR的作用。综上所述，脂肪组织分泌的TNF-Q、IL-六、CRP炎症因子可降低胰岛素的灵敏性，参与IR的发生，中药糖耐康能降低炎症因子的水平从而改善IRo在3T3-L1脂肪细胞中，这些炎症因子启动哪条炎症信号通路致使IR的形成；中药糖耐康具有西药吐格列酮相似的作用，是不是通过发挥激活PPAR丫来改善IR,尚有待进一步深切研究。【参考文献】1FestaAD,AgostinoRD,HowardG,etinflammationaspartoftheinsulinresistancesy

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