临床生物化学实验原理方法及检测介绍

1、临床生物化学实验原理、分析方法及检测技术中国中医研究院广安门医院临床检测中央生物化学实验一一是把化学分析技术和生物化学实验反响原理的方法应用于疾病的诊断、治疗、监控的实验分支.一个生化实验的最后测定结果应包括四大局部来完成.1、 实验反响原理及分析方法理论依据2、 实验检测技术手段生化仪的分析技术.3、 质量限制程序质量保证室内质控、室间质评、仪器、试剂、人员五要素.4、 临床意义目的咨询效劳、异常结果的解释.实验反响原理及分析方法理论依据一个生物化学实验的反响原理设计,首先要找出所检测的化学特性,如测定体液首先是血液中酶的含量血液中除少数酶如凝血溶血酶、铜氧化酶及假性胆碱脂酶等含量较多外,血

2、液正常生理状况下含量微乎其微.一般每毫升含微微克Pg水平,要直接测定如此微量物质是相当困难的.用免疫化学方法可测定全部酶蛋白分子含量不管其有无活性而用化学方法测定只能测定酶的催化活性,间接计算出酶的含量.目前利用酶具有催化活性这一特性,在临床上已普遍应用测定酶蛋白,同时还可以测定三大代谢的产物,如糖、脂类、蛋白质、这样也就建立起利用酶促反响的一级反响测定代谢物的方法.一级反响一反响速度与底物浓度成正比,因此只有当酶反响为一级反响时,才能准确测定底物含量,如测定血糖、总甘油三脂、总胆固醇等.从此在临床试剂盒的方法中出现了以酶为试剂测定各种代谢产物.临床化学方法的分类特别是自动生化仪方法的特点以往

3、临床化学实验都采用比色法进行各个工程的测定,这是由于比色法具有微量、迅速、准确的优点,特别适合于微量的生物体体液中各项物质测定.在一般比色法中,手工使用比色计或分光光度计可以测定各种反响溶液的吸光度,但由于很难限制测定时间和反响温度,很难准确记录反响过程中吸光度变化,因此,毫不奇怪在很长一段时间内我们所使用的方法,都是在呈色反响到达完全或者反响到达平衡时,吸光度到达稳定时才进行测定.即所谓平衡法或终点法.但自从自动生化仪出现后,从根本上改变了上述情况.通过各项先进技术,人们可以精确测定反响的动态过程.并可以准确计算任何一段反响时间内的反响速率,这样大大开阔了临床化学家对方法选择.除经典的终点法

4、外还可以进行动态测定.这样不仅缩短了操作时间,大大提升了工作效率,还可进行一些用常规比色方法不能进行的测定.如测定酶反响的初速度V.等等.测酶初速度V.只能用分光光度法.因此,用好自动生化仪一个重要前提必须对自动生化仪可以提供的测试方法类型有所了解.生化自动分析仪特点：1精确测定反响的动态过程；2准确计算任何一段反响时间内的反响速率;3除经典的终点法外还可以进行动态测定.分析方法的分类临床化学常用方法按表1分类：表1分析方法分类分析方法中的测定步骤物理化学物理方法平厢I一动态法平衡法动态法I可变信5s-M信号法在临床化学中绝大多数方法都是所谓物理一一化学方法.也就是将所测定物质进行一些化学转化

5、后再进行测定.例如在实际工作中测胆红质,不是直接在nm测定,而是先进行重氮化反响后比色定量测定生成的有色偶氮化合物.绝大多数化学反响都经历一个类似图1的反响过程.图中虚线明显将反响分为二个截然不同时期,左面期中所测的产物浓度在不断变化之中,由传感Sensor所得到的信号也在相应改变之中.如所用的方法主要是根据这期间所获得的信号进行计算,这称之为动态法.相应在图中虚线右边时期,传感器所得到信号相对不变,如根据平衡期时间图1化学反响的过程这些信号计算的方法称之为平衡法.从科学上说此术语显然比终点法更为确切,由于信号无变化,不一定意味着反响完全到达终点.正由于在这期内传感器所得到信息变化不大,因此对

6、测定的条件如时间,浓度,PH要求远没有动态法那样严格,所以不要求特殊仪器,而且精密度较高,非常适宜于一般仪器和实验室使用.图1也同样适用于酶催化的反响,在动态期酶所催化产化的物质处在一个动态变化之中,在酶作用一段时间后,由于基质消耗逆反响出现,底物的抑制作用等,反响速率愈来愈慢,最后到达平衡期.此时基质和产物浓度不出现变化,因此很清楚如要测酶活性,只能在动态期测定酶所催化反响的速率.所以严格说测酶方法不管用自动生化仪,记录或分光光度计或普通比色计都包括在动态法的范围内.平衡法终点法这是目前我国生化实验室常用也是大家所熟悉的方法.其特点是对测定条件尤其是测定时间和温度要求不严格,所以容易掌握,计

7、算结果方便,精密度好,但由于反响到达平衡需要一定时间,一般都需十分钟以上,因此整个操作时间长,工作效率低,目前不少自动生化仪特别是离心式分析仪改用动态法.即使采用平衡法时也对方法进行修改,设法缩短动态期.例如同是糖激酶一一葡萄糖一6一磷酸脱氢酶法测血糖,手工法往往需15分钟后比色,但在自动生化仪中由于加大工具酶用量,在3分钟内就到达终点.另外应用计算机技术在每一个标本到达平衡时就可分别进行终点测定.近年来有一种倾向就是将特异性较差的化学法改为特异性酶法.即以酶作为试剂来测定血中各种代谢物质.这类方法和经典的平衡法有所区别,下面做一个简单表达：这类方法特点是被测物质酶反响的基质在酶反响过程中完全

8、被转化或消耗掉即达到反响终点,通常这类方法操作简单,一般不需要作标准管,通过一些的理化常数例如克分子吸光系数等不难将结果计算出来,其缺点是反响时间较长,特别不适合于离心式自动分析仪.另有少数酶反响,基质并未完全消耗掉,只是到达一个动态平衡,此时往往需要同时作标准管.动态法连续监测法动态法一一即根据某一物质对一个反响的催化或延缓作用来测定期含量,这是通过秒表测量反响延缓时间而到达此点.从六十年代开始,动态法得到迅速开展,这是由于一系列高技术开展的结果：出现了高质量的电化学和比色传感器,温度限制的比色杯,迅速混匀技术,以及自动数据处理系统等,人们防止了繁杂的计算,可以迅速直接得到测定结果,满足了临

9、床医学大量生化标本的要求.反之动态法的使用也大大推动临床化学开展,仅用有限人力可以测定成十倍原来的工作量.如测酶活性全部使用此方法.实验检测技术生化分析仪的分析原理人体的供能、合成与代谢是由、糖碳水化合物、蛋白质、脂肪来完成的.临床上蛋白质的检测是测定蛋白质的20多种氨基酸,采用的是吸收光谱和分光光度法.生化分析仪的组成：分析系统、数据处理系统计算机、显示器、打印机附件等.全自动生化分析仪还配有电解质系统ISE.生化分析仪适用于医学实验室血液中物质含量的测定,也可测定体液中小分子量的物质.生化分析仪最简单的测定原理一一单色光测定反响物浓度的吸光度ODfi.比色分析的根本原理许多化学物质的溶液具

10、有颜色无色的化合物也可以加显色剂经反响生成有色物质,当有色溶液的溶度改变时,颜色的深浅也随之改变,浓度愈大,颜色愈深.因此,可以用比拟溶液颜色深浅的方法来测定有色溶液的浓度.这种方法叫做比色分析法.一、朗伯比尔定律当一束单色光通过有色溶液时,入射光线的一局部被器皿反射回来,一局部被溶液吸收,另一局部那么透过溶液,如下图.他们之间有以下关系：1口=1也+1M式中：L一入射光强度L-*h吸收光强度k七：二二浓度c二二一.,_=一一一一i>1|lr反射光强度二二二二二二二I一透过光强度由于在实际测定时,所用的比色皿都是同质料用规格的,反射光的强度为一定值,不会引起测量误差,所以反射光的影响可以

11、不加考虑.那么上式可简化为：产L+L1-2从式1-2可知：当入射光的度为一定时,被吸收光强度L愈大,那么透过光强度h愈小.也就是说：光强度的减弱仅勺有色溶液对光线的吸收有关.那么,溶液对光线的吸收与哪些因素有关呢？实验证实：溶液的浓度C愈大,液层厚度L愈厚(即光线在溶液中所经过的路程愈长),那么溶液对光线吸收的愈多.它们之间的关系有下式决定：1g=KCL1-3I.这个公式就是朗伯比尔(Lambert-Beer)定律.公式中的K称为吸光系数,它表示有色溶液在单位浓度和单位厚度时的吸光度.在入射光的波长、溶液种类和温度一定的条件下,K为定值.吸光系数是有色化合物的重要特性之一,在比色分析中有着重要

12、的意义.K值愈大,表示该物质对光的吸收水平愈强,浓度改变时引起吸光度的改变愈显著,因此比色测定时灵敏度愈高.朗伯比尔定律即力.色溶液对一定强度光的吸收程度,与液层厚度和溶液中有色物质浓度的乘积成正比.其中朗伯定律说明吸收光与厚度间的关系；比尔定律说明吸收光.浓度间的关系.朗伯一比尔定律在光电比色计中的应用假定有两种有色溶液,其中一种是浓度的标准溶液,另一种是待测溶液.根据公式：在标准溶液中：As二KCsL1-4在待测溶液中：Ax=kxCxLx1-5将式14除以式1-5可得：AsK.CsLs=1-6AxKXCXLX如果上述两种溶液的液层厚度相等、温度相同而且是同一种物质的两种不同浓度的溶液,测定

13、时所选用的单色光的波长亦相同,那么力.:Ls=Lx>K=Kx,代入式I-6可得:A,Cs1-7由此可见,在上述条件下,吸光度与浓度成正比Q这一关系式就是光电比色计的设计依据,也是比色分析的根本计算公式之一.式中标准溶液的浓度G为,A和AJ可用光电比色计测量出来,那么待测溶液的浓度G即可求出:Cx=XCs1-8A山于在实际测定时,标准溶液和待测溶液都要加以稀释,而旦在报告结果时,多以100亳升或10电升中的含量来表示.|因此,在实际计算时,就需要在上式中乘上稀释因数.求待测溶液浓度的方法有：直接比拟法计算法,因数法和标准曲线法三:种中这些方法在“生物化学及生物化学检验技术课程中有介绍中波长

14、的选择：由于在实际测定时,标准溶液和待测溶液都要加以稀释,而且在报告结果时,多以100毫升或1000毫升中的含量来表示.因此,在实际计算时,就需要在上式中乘上稀释因数.求待测溶液浓度的方法有：直接比拟法计算法、因数法和标准曲线法三种.这些方法在“生物化学及生物化学检验技术课程中有介绍.波长的选择：由于有色溶液对光的吸收具有选择性,因此进行比色测定时,滤光片必须加以选择,否那么灵敏度很低,导致测量结果不准确.选择滤光的一般原那么是：滤光片最大透过的光线应该是溶液最大吸收的光线.从颜色上看,滤光片的颜色与待测溶液的颜色应为“互补色.什么叫做互补色呢？但凡两种颜色相加后能得到白色,那么此两种颜色就称

15、为“互补色,图中直接相对的两种颜色,均为互补色.为什么选择滤光片时,要使滤光片的颜色与待测溶液的颜色为互补色呢？这是由于滤光片和有色溶液具有相似的透光特性,与它们本身颜色相同的色光,能够最大限度地透过.而与它们本身颜色成互补的色光都能被最大地吸收.待测溶液和滤光片的颜色待测溶液颜色滤光片波长范围nn颜色绿紫300-400黄绿青紫430-440黄兰440-450橙红兰绿450-480红绿兰490-530青紫黄绿540-560兰黄570-600兰绿橙红600-630绿兰红630-780质量限制程序质量保证室内质控IQC包括精密度,一般用CV%室间质评EQ侬括准确度,一般用偏差.参考系统的选择及溯源

16、性包括仪器自身校准溯源及国家的溯源系统检测系统的稳定性以及仪器的校准.自动生化分析仪使用中的校准对自动生化分析仪检测系统精密度和准确度的验证仪器、试剂、校准品、操作程序等的组合为一一检测系统.生化室自定了检测系统一一并使用了带溯源性的仪器、试剂、校准品、操作程序.实验结果具有可靠的溯源性.检测系统包括四局部外,手工操作还必须包括具体操作人员.所以我们认为在检测系统中任何一个组分的改变,都会影响检测结果.在确定仪器、试剂等的性能其实都是组合的检测系统的共有性能.建立校准方法,选择适宜的校标准品,包括校标准品的树木、类型和浓度；如有可能,校标准品应溯源到参考方法和/或参考物质；确立校准的频度.校准

17、验证：有可能,方法应追溯到参考方法或值的参考品；确定校标准品的数目,类型和浓度,校准验证的接受限,以及校准验证的频度；确定检验结果的报告范围,确定时必须包括一个最小值或零,和此范围上限的最大值.至少每六个月以及有以下情况发生时,进行一次校准：改变试剂的种类,或者批号.但如实验室能说明改变试剂批号并不影响结果的准确,那么可以不进行校准.仪器或者检测系统进行过一次大的预防性维护或者更换了重要部件,这些都有可能影响检测性能.质控反映出异常的趋势或偏移；或者超出了实验室规定的接受限、采取一般性纠正举措后,不能识别出和纠正问题时.所有进行过的校准和校准验证工作都必须记录并写成文件.1 .酶活力单位的计算

18、.国际单位一规定一个国际单位为在实验室规定条件下如370G最适合的PH最适底物浓度时每分钟催化一个微摩尔底物变化所需要的酶量.2 .什么是法定计量单位.一般采用摩尔单位,凡分子量的物质算出相对分子量Mr或相对原子量Ar.mg/dl与mmol/L的换算,求出系数.3 .实验中尽量防止基质效应.体外诊断试剂盒性能指标以OLYMPUS产的甘油三脂试剂盒为例.分析批内CV3%总精密度CV5%30天定标一次原厂家定标液,溯源追踪到CAP的血清脂类RMO16#2更换试剂批号,质控出现漂移,仪器做保养后重要零件更换时作定标.线性范围10至1000mg/dl,用mmol/L报告时x0.0113.干扰性乳糜到达

19、500mg/dl影响7%胆红素到达32mg/dl影响10%抗坏血酸到达20mg/dl影响1%病人准备：10-14小时进食,如用血浆肝素和EDTAK凝.标本稳定性4度稳定7天,-20度稳定3个月.为什么要定标？多长时间要定标一次?定标的意义：定标就是要找出一个参考点,就是一个K值或F值.它是由仪器与试剂状态确定下来的.当我们测定一个标本时,无论您是用手工的方法或全自动生化分析仪,测出来的值只是一个吸光度,这个吸光度对我们没有什么意义,我们要把这个吸光度转化成一个浓度或是酶的活性.那就要乘上一个K值,计算并打印出来的结果对我们就有意义了.K值就是我们通过定标找出来的.一般上最低要求是由试剂空白与标

20、准品.经过仪器测定出两个吸光度.一标准浓度一试剂空白K=A标准一A试剂空白试剂空白通常是0标准液的浓度我们是知道的,这两个吸光度可以由仪器测出,这样就得出一个K值.无论什么样的标本,用其吸光度乘以K值我们就得到了答案.因此,K值具有非常决定性的意义,可以决定标本的准确性.K值的决定因素：我们看看K值会受到什么影响呢？第一,标准液的浓度一定要准确标准液最好与标本一样是以血清为基质的.第二,标准液的吸光度与试剂空白的吸光度一定要准确.吸光度受仪器状况、试剂状况的影响,如果您的仪器相当稳定,试剂是影响K值的一个主要因素.如何确定K值是正确的？一般我们用质控血清来检查,最好是两种水平的质控来检查,如果

21、质控结果很好,可以说K值是准确的,用这个K值计算出来病人的结果也是准确的,所以K值非常关键.K值的真面目：K值实际上代表了斜率,截距代表试剂空白,试剂空白每天都在变化,所以K值的稳定性决定您的仪器与试剂,如果仪器与试剂都十分稳定,那K值也很稳定.多长时间定一次标适宜？这要看您试剂的稳定性,质控结果不好,有些工程做试剂空白可以解决,有些工程要做两点定标.酶的工程如何确定K值：一是计算出来的理论K值；TVX1000K=SVxLx£二是用有酶工程的定标液得出K值：目前各公司可以提供多工程的定标液,不仅有底物类的工程,也有酶类的工程.测定特种蛋白为什么要用多点定标透射免疫比浊时,由于抗原与抗体结