关于HPLC法检测血清中伏立康唑含量的研究

1、关于HPLC法检测血清中伏立康唑含量的研究     关于HPLC法检测血清中伏立康唑含量的研究,关键词是伏立康唑,血清样本,含量测定,            【摘要】 目的 建立人体血清样本中伏立康唑含量检测 方法 。方法 色谱柱为依利特C18柱(5m，4.60mm×200mm);流动相为水：乙腈：冰醋酸：三乙胺=64：36：0.1：0.05;流速：1.2ml/min;检测波长:258nm。结果 伏立康唑在0.1413.96g

2、/ml浓度范围内呈良好的线性关系，r=0.998。结论 实验建立的HPLC方法可以用于血清样本中的伏立康唑含量检测。【关键词】 伏立康唑 血清样本 HPLC 含量测定【Key words】 voriconazole; serum sample;HPLC;determination伏立康唑(voriconazole,VRC)是一个三唑类抗真菌药物，其作用机制是抑制真菌细胞色素p450依赖的14-固醇脱甲基酶，而本品对于真菌细胞色素p450酶比对各种哺乳动物的细胞色素p450酶系统更具选择性。伏立康唑在0.0364g/ml的浓度范围内对几乎所有的实验真菌，包括致病性酵母菌和丝状菌属及双芽生菌的分离

3、菌株均有作用。对一些条件致病真菌如曲霉菌属、隐球菌属及念珠菌属包括对氟康唑耐药的克柔念珠菌均有抗菌活性。本实验旨在建立血清样本中伏立康唑浓度检测方法。1 实验材料伏立康唑对照品，中检所提供。卡马西平对照品，中检所提供。乙腈：色谱纯，天津市科密欧化学试剂开发中心，批号：20051120。冰醋酸： 分析 纯，天津市化学试剂三厂，批号：20061228。三乙胺：分析纯，天津市东丽区天大化学试剂厂，批号：20040806。Waters515高效液相泵，717自动进样器，996紫外检测器，Empower色谱工作站。2 色谱条件及血浆样本处理方法142.1 色谱条件 色谱柱为依利特C18柱(5m，4.60

4、mm×200mm);流动相为水：乙腈：冰醋酸：三乙胺=64：36：0.1：0.05;流速：1.2ml/min;检测波长：258nm;柱温：室温。2.2 标准液制备 精密称取伏立康唑对照品0.0340g，加甲醇溶解于50ml容量瓶中并稀释至刻度,即得698g/ml的伏立康唑对照品溶液。精密称取卡马西平对照品0.0050g，用流动相溶于100ml容量瓶中并稀释至刻度，即得50g/ml的内标溶液。2.3 血浆样品的处理 取血浆0.2ml，内标10l(卡马西平50g/ml)，混匀，再加入0.5ml甲醇，旋涡振荡0.5min，16000r/min离心5min; 吸取上清液100l进样。3 方法

5、学 研究A：卡马西平, B：伏立康唑图1 伏立康唑色谱图3.2 标准曲线及线性回归方程 用伏立康唑对照品溶液(698g/ml)配制标准曲线工作液：将698g/ml对照品溶液依次用流动相稀释，得到2.79、8.37、27.92、55.84、139.60、279.20g/ml。取空白血浆0.19ml分别置于系列试管中，分别加上述标准曲线溶液各10l，配制成血浆浓度为样，按上0.14、0.42、1.40、2.79、6.98、13.96g/ml的血浆标述4方法处理血浆样品，测定样品及内标的峰面积， 计算 其峰面积比值(伏立康唑/卡马西平，A)，以峰面积比值A对血浆浓度C进行线性回归分析，求得线性回归方

6、程为： C = 5.117 A +0.024 (w=1/cc)，r=0.998。结果表明，伏立康唑血浆浓度在0.1413.96g/ml浓度范围内，线性关系良好，血浆样品可进行定量检测的最低浓度为0.14g/ml。见图2。图2 伏立康唑血浆标准曲线3.3 绝对回收率 各取空白血浆0.19ml于15个空白试管中，5个为一组，分别加入8.37g/ml(低浓度)、55.84g/ml(中浓度)、139.60g/ml(高浓度)伏立康唑对照品溶液10l。得浓度为 0.42g/ml、2.79g/ml、6.98g/ml的血浆样品。按上述4方法处理血浆样品，进样100l，记录色谱峰面积。 另外，用纯水代替血浆重复

7、以上步骤，记录色谱峰面积。以此为标准，将两组峰面积进行比较， 计算 伏立康唑的绝对回收率，结果见表1。3.4 相对回收率试验 各取空白血浆0.19ml于15个空白试管中，5个为一组，分别加入8.37g/ml、55.84g/ml、139.60g/ml伏立康唑对照品溶液10l，得浓度为0.42g/ml、2.79g/ml、6.98g/ml 的血浆样品。按上述4 方法 处理血浆样品，进样100l，记录色谱峰面积的比值。将比值代入标准曲线，与 理论 值进行比较，计算伏立康唑的相对回收率，结果见表1。3.5 精密度试验 取空白血浆0.19ml置于离心管中，分别加入已配制好的8.37g/ml、55.84g/

8、ml、139.60g/ml伏立康唑对照品溶液各10l，按上述4血浆样品处理方法处理后，得血浆浓度为0.42g/ml、2.79g/ml、6.98g/ml的血浆标样各15份，按上述4方法处理血浆样品，于同日和连续2日内各进样100l，测定样品和内标的峰面积，计算其峰面积比值(A)，并按回归方程求出对应浓度，以此计算其日内和日间变异，结果见表2。 表1 回收率试验表2 精密度试验3.6 稳定性试验 取空白血浆0.19ml置于离心管中，分别加入已配制好的8.37g/ml、55.84g/ml、139.60g/ml伏立康唑对照品溶液各10l，得血浆浓度为0.42g/ml、2.79g/ml、6.98g/ml

9、的血浆标样各20份，分别于配制后立即、室温放置4h后，24h后反复冻融三次和1个月后，按上述4血浆样品处理方法处理，测定样品和内标的峰面积，计算其峰面积比值(A)，并按回归方程求出对应浓度并比较测定浓度，以考察样品稳定性。结果见表3。4 结果5 结论本实验建立起的HPLC检测伏立康唑血清样本含量的方法可行，检测的数据真实可靠，可以作为血清样本中伏立康唑含量测定方法。表3 样品稳定性试验表4 血清样品中伏立康唑检测结果【 参考 文献 】1 国家药典委员会.中华人民共和国药典, 2005版.北京:化学 工业 出版社,2005，附录：28-30.2 Dominique Leveque, Yasmin

10、e Nivoix , Francois Jehl ,et al. Clinical pharmacokinetics of voriconazole. International Journal of Antimicrobial Agents, 2006,(27) :274-284.3 G Srinubabu, Ch AI Raju, N Sarath,et al. Development and validation of a HPLC method forthe determination of voriconazole in pharmaceutical formulation using an experimental design. Talanta ,2007,(71):1424-1429.4 St'ephanie Chhun, Elisabeth Rey, Agnes Tran,et al. Simultaneous quantification of