抗PTDbcrabl单克隆抗体的制备及鉴定

1、抗PTDbcr/abl单克隆抗体的制备及鉴定         11-01-31 10:11:00     作者：陈任安    编辑：studa20【摘要】  目的: 制备单克隆抗体（mAb）并初步用于PTDbcr/abl融合蛋白的研究, 为慢性粒细胞白血病的免疫治疗提供实验依据。方法: 在大肠杆菌中表达PTDbcr/abl融合蛋白, 用所获得的蛋白免疫BALB/c小鼠, 常规收集小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合, 筛选杂交瘤细胞

2、株的阳性克隆, 并对其进行一系列鉴定。结果: （1）表达PTDbcr/abl融合蛋白; （2）制备了抗PTDbcr/abl融合蛋白mAb; （3）用mAb以多种方法检测PTDbcr/abl融合蛋白, 证实此抗体效价高, 特异性强。结论: 此抗体可用于PTDbcr/abl融合蛋白的进一步研究。 【关键词】  PTDbcr abl融合蛋白 单克隆抗体 制备    PTDbcr/abl是一种利用基因工程合成的融合蛋白1, 2。其中PTD（蛋白转导结构域）是人类免疫缺陷病毒（HIV）1所编码的反式激活蛋白TAT的一段多肽片段, 具有独特的跨膜转运方式, 其特点是

3、转导速度快, 效率高。Schwarze等3发现将PTD融合于相对分子质量(Mr)为15×1032×105的蛋白时, 可介导这些蛋白从细胞外向细胞内直接跨膜转运。Bcr/Abl是慢性粒细胞白血病（CML）细胞中特异的bcr/abl融合基因所编码的融合蛋白, 其Mr为21×104, 具有异常的酪氨酸激酶活性。我们以前已利用基因重组方法构建了PTDbcr/abl的原核表达质粒, 并在大肠杆菌中获得表达。而且证实表达产物PTDbcr/abl融合蛋白与K562或HL60细胞共同孵育后, 可进入细胞内1。我们用纯化的PTDbcr/abl融合蛋白抗原免疫BALB/c小鼠, 常规

4、收集小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合, 筛选杂交瘤细胞株的阳性克隆。经ELISA、 Western blot及免疫组化方法检验, 证实mAb特异性强, 效价高, 可用于PTDcr/abl融合蛋白的进一步研究。1  材料和方法1.1  材料 大肠杆菌BL21购自Navagene公司。表达PTDbcr/abl融合蛋白的质粒pET16bPTDbcr/abl、 HL60、 K562细胞株由本室构建保存; BALB/c小鼠由第四军医大学实验动物中心提供; 免疫组化试剂盒(链亲和素抗生物素蛋白过氧化酶免疫组化超敏试剂盒)购自迈新公司; 小鼠IgG亚类快速定性试纸购于法国Arge

5、n公司; HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体(由华美生物提供); 免疫球蛋白标准亚类试剂购自Sigma公司。1.2  方法bcr/abl融合蛋白的表达与纯化 质粒pET16bPTD与质粒pET16bPTDbcr/abl的制备按照文献1进行。用pET16bPTDbcr/abl转化大肠杆菌BL21, 取阳性克隆培养扩增, 用IPTG进行诱导表达后收集菌体, PBS悬浮, 超声裂菌, 并用8 mol/L脲溶解蛋白, 用8mol/L脲（pH值分别是8.0、 6.3、 5.9、 4.5）在NiNTAagarosePAGE电泳, 成为蛋白胶。按参考文献4进行。取蛋白胶（含蛋白1） 40 m

6、g与125 L完全福氏佐剂, 125 L PBS充分研磨后, 背部皮下多点注射免疫BALB/c 小鼠。2周后用蛋白胶（含蛋白1） 40 mg与125 L不完全福氏佐剂, 125 L PBS充分研磨后, 皮下多点注射, 连续3次, 每次间隔2周, 第3次免疫后14 d, 用PTDbcr/abl 纯化蛋白50 g/500 L小鼠腹腔注射, 加强免疫1次, 3 d后取小鼠脾脏待用。取免疫小鼠脾细胞与Sp2/0细胞按101的比例, 在500 g/L(W/V)PEG 4000介导下融合, 融合细胞用HAT培养基做选择性培养, 37、 50 mL/L CO2孵箱培养, 7 d后改用HT培养基培养。采用间接

7、ELISA法做交叉筛选。将PTDbcr/abl融合蛋白和HisTaxreb107(另一带有His标签的蛋白, 文章另发)(对照孔)稀释为10 mg/L, 包被96孔酶标板, 100 L/每孔, 4包被过夜, 次日用10 g/L BSA 120 L/孔封闭后,  分别取待测杂交瘤上清液100 L加入PTDbcr/abl融合蛋白和HisTaxreb107包被板中, 4过夜; 用PBSTween20洗板5次, 加HRP羊抗鼠IgG(11000稀释) 100 L/孔, 37、 1 h; PBSTween20洗板5次, TMB显色; 2 mol/L H2SO4终止反应。置酶标仪450 nm波长测量A值, A450值大于阴性对照孔2.1倍以上为阳性, 选取PTDbcr/abl融合蛋白阳性而HisTaxreb107阴性的孔细胞, 采用有限稀释法进行亚克隆, 至所有杂交瘤上清液均呈阳性为建株标准。每只BALB/c小鼠腹腔内注入0.5 mL液体石蜡, 1周后将阳性杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内, 5×106杂交瘤细胞/只。大约710 d后收集腹水, 按常规经饱和硫酸铵盐析、 ProteinG亲和层析进行纯化。用紫外分光光度法测定其浓度, 加入终浓