针对Bt转基因大米结构特异基因的实时荧光(Real-time)PCR检测方法的研究

1、附件二：参考译文：针对Bt转基因大米结构特异基因的实时荧光（Realtime）PCR检测方法的研究Dietrich Made， Christine Degner， Lutz Grohmann摘要：中国的转基因大米品系已接近获得农业种植与生产的批准。但是，迄今还没有检测此转基因作物的方法进行报道。在本研究中，以田间测试为Bt大米（“Anti-pest Shanyou 63<抗虫籼优63>”和“Anti-pest Jinyou 63<抗虫粳优63>”）做为研究对象，对其转基因DNA序列进行研究。Real-time PCR检测方法针对的区域为苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白基因cry

2、IA（b）及cryIA(c)融合基因和农杆菌的胭脂碱合成酶基因（nos）终止子之间的序列。此Bt大米特异检测体系吸纳了最近发表论文中Real-time检测大米（Oryza sativa L）内源基因gos9的内容。检测转基因Bt大米的整个方法进行了内部验证，确定检测限值为0.1（Bt大米 / 大米整体）。应用PCR方法可更精确地检测欧盟尚未批准的转基因大米。关键词： 转基因生物，大米（Oryza sativa L），Bt毒蛋白，内源基因，Real-time PCR, 检测方法简介在欧盟，转基因（GM）食品的批准与使用应遵照法令(EC) No 1829/2003和(EC) No 1830/200

3、3的规定1,2。由于全球的转基因作物的种植不断增长，欧盟各成员国必须依据这些规定进行全国食品监督，以防止含有或来源于未经欧盟批准的转基因生物的食品与饲料进入欧盟市场。亚洲的植物转基因产业是新的转基因作物品性的主要集中地，许多已接近获得批准和可能很快就投放市场3。在中国，水稻的种植面积超过20，并通过大量使用除草剂和杀虫剂达到了较高的产量。能抵抗害虫或除草剂的转基因大米可以减少此类化学品的用量3,4。几个不同的转基因水稻品系已在公众的GMO资料库有所描述5,6。至少四个已经通过了田间试验、环境释放试验，目前正处在预生产阶段。一种含有Xa21基因可以抵抗白叶枯病的转基因水稻在2001年就进入了预生

4、产阶段，但中国农业部没有最终批准，原因是需要更多的生物安全资料。另一种转基因水稻被转入了豇豆胰蛋白酶抑制（CpTI）基因以获得抗虫特性，在1999年被批准进行环境释放试验，之后被引入杂交水稻GM II-Youming 86，2001年开始进入预生产阶段。已经被研究并批准进行环境释放的表达Bt毒蛋白的转基因水稻至少优两个Bt水稻品系,“GM Shanyou 63”和“Kemingdao”在2001年进入预生产阶段。去年，国际环保组织绿色和平（Greenpeace）对中国市场上的GM水稻品系进行了调查。从中国湖北省的当地种子公司、农业推广站和农场购买了一些大米样品。由一家商业的GMO检测实验室对所

5、采集的样品进行了DNA与蛋白方面的检测。25个样品中的19个显示存在转基因大米。几个样品的DNA扫描检测为阳性，同时CryIA(c)蛋白检测也为阳性，提示这些大米品系表达Bt蛋白。检测GMOs的分析方法和在食品或饲料中含量的方法主要是基于DNA的聚合酶链式反应（PCR）。由于Real-time PCR具有的高特异性、使用方便的特点，都能应用于GMO定性与定量检验。大多数Real-time PCR进行扩增时都是采用水解荧光探针（TaqMan）。为了满足GMO含量检测的需要，欧盟对于单倍体基因组拷贝也采用此类方法。为了建立转基因作物的检测方法，必须要得到阳性检验材料。但是对于在欧盟没有进行研究和种

6、植的或者没有得到欧盟批准的转基因品系，是非常难于获得可信的阳性材料。为了建立针对在中国已接近商业化种植而欧盟还未批准的转基因大米的检测方法，我们使用了绿色和平（Greenpeace）进行调查时的两个大米样品做为参考材料。在推测参考材料含有GM Shanyou 63大米的基础上，建立了Real-time PCR方法检测部分结构特异性基因。本研究所建立的Bt大米品系检测方法也可以应用于进口食品中该成分的定量检测。材料和方法样品材料与DNA的提取两个转基因大米样品（FR0502519，FR0502520）是由绿色和平友情提供，此样品为2005年春季在中国湖北省松滋（Songzi）县王家桥（Wangj

7、iaqiao）镇农业推广站的水稻种子包装中采集。样品标记为“Anti-pest Shanyou 63（抗虫籼优63）”和“Anti-pest Jinyou 63（抗虫粳优63）”。使用改良的CTAB核酸提取方法从粉碎材料中提取DNA。200mg粉碎过的大米样品中加入1.5ml CTAB 提取缓冲液（20g/L CTAB,1.4mol/L NaCL,0.1mol/L Tris-HCL,0.02mol/L Na2EDTA, pH8.0）和10µL蛋白酶K溶液（20mg/mL)，60振荡过夜后13000×g离心10min，转移上清液到新的离心管中。加入750µL氯仿后用

8、力振荡，13000×g离心5min，将上清转移到新的离心管中。加入2倍体积的CTAB沉淀溶液（5g/L CTAB, 40mmol/L NaCl），室温静置60min，13000×g离心15min，弃去上清，加入350µL NaCl溶液（350mmol/L）将沉淀进行悬浮，再加入350µL 氯仿，涡旋振荡进行混匀，13000×g离心10min，转移上清后加入0.6倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min，13000×g离心10min，弃去上清，加入500µL 70乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于200µL TE溶液中（

9、1mmol/L Tris-HCL, 0.1mmol/L，Na2EDTA, pH8.0）。按照PicoGreen dsDNA结合染料（Invitrogen）的使用说明，使用fluorrometric方法对提取的DNA进行定量。使用ABI PRISM 7900以525nm 波长进行测定。使用含量为0.1µg /µL DNA的100bp DNA 标记（Fermentas）进行校准。对于特异性试验，在德国市场上购买两个传统品牌的普通大米（Wurzener Parboiled，批号L 60531E, Wurzen，德国；Gut Gunstig SpitzenLangkornReis，

10、批号07/02/2008, Hamburg，德国），转基因大米品系LL RICE62，转基因大豆品系GTS40-3-2, 转基因玉米品系T25、Bt11、Bt10、Bt176、MON810、MON863、NK603、TC1507、GA21与CBH351。分别提取DNA用于试验。对于敏感性试验，用0.1×TE溶液对样品FR0502519和FR0502520所提取的DNA进行四倍梯度的系列稀释。另一种系列稀释液是使用FR0502519的提取DNA和传统大米DNA（Wurzener Parboiled, 10µg/mL）与玉米DNA(10µg/mL)的混合液。不同GMO

11、成分的质量比率混合物是使用粉碎的传统大米和转基因大米样品FR0502519进行制备。9.5g传统大米与0.5g 大米样品FR0502519混合后得到5（w/w）混合物来做为起始材料。2 g 的5（w/w）混合物加到8 g 传统大米中得到1（w/w）混合物。5 g 的1（w/w）混合物加到5 g 传统大米中得到0.5（w/w）混合物。2 g 的0.5（w/w）混合物加到8 g 传统大米中得到0.1（w/w）混合物。对于后续的定量real-time PCR检测可以使用5、0.5与0.1混合物所提取的DNA。PCR 和 DNA测序PCR扩增体系的体积为25µL，包括2.5ul 10xbuf

12、fer（含15mmol/L MgCL2），0.5µmol/L引物，0.625U Taq(HotStar,Qiagen)和1µL 模板DNA（约为25ng）。反应程序为95预变性15min，94/30s、60/30s、72/1min进行45个循环，最后72延伸7min，用常规PCR方法和real-time PCR按照描述来检测CaMV 35S启动子和Nos终止子序列14，18。对于转基因结构的基因测序，将样品FR0502519和FR0502520所提取的DNA用于PCR试验，引物为RiceActin 1f（5ccc tct cct ctt tct ttc tcc g3）和NO

13、S180R（5TTg TTT TCT ATC gCg TAT TAA Atg T3）。其它PCR使用的引物为NOS-1（5gAA TCC TgT TgC Cgg TCT Tg3）、NOS-3（5TTA TCC TAg TTT gCg CgC TA3）和CryIA（b）F（5ACC ATC AAC AgC CgC TAC AAC gAC C3）, 反应条件参考相关文献14,17,18。PCR产物用QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化，直接使用BigDye Terminator V1.1 测序试剂盒进行测序。首先使用Sequence Navigator 软件对核酸序列进行比较，再用BLAST

14、 2在GenBank序列数据库中进行搜索分析19。Real-time PCRReal-time PCR在ABI PRISM 7900仪器进行。在96孔板上所有的样品进行双平行检测。25µL反应液包括12.5µL universal master 反应液（ABI）、表1所示浓度的引物与探针、5µL 模板DNA。反应条件为95预变性10min，95/20s、60/1min进行45个循环。引物T51F、T51R 与T51P使用Primer Express 2.0 软件进行设计。大米内源基因的引物与探针引用已发表论文的real-time PCR方法20, 21。结果与讨论

15、转基因大米样品的序列分析2005年对Greenpeace从中国当地批发商购买的两个大米样品进行基因测序。 首先对FR0502519和FR0502520两个样品进行GMO筛选检测。两个样品的Bt蛋白检测均为阳性，NOS终止子DNA检测也都为阳性，只有一个样品FR0502520的CaMV35S 启动子的DNA检测为阳性。用35S启动子的real-time PCR检测重新进行检测，结果显示FR0502520的DNA的35S检测结果非常弱，Ct值约为35，使用相同模板量时NOS终止子的real-time PCR检测结果的Ct值约为24。我们推测在样品FR0502520可能存在另外的GMO品系，因为GM

16、 Shanyou 63品系中不应含有CaMV35S 启动子，其亲本CMS restorer品系Minghui 63是去除了35S 启动子所调控hph标记基因22。使用几个不同的引物组合针对GM Shanyou 63中含有的预测转基因结构，将PCR产物用于直接DNA测序（Fig. 1）。所测的核苷酸序列在NCBI 中用BLAST 进行分析比较。转基因序列的两个连接区域与GeneBank中的序列是一致的(Fig. 2和Fig. 3)。为了进一步分析大米样品中的转基因序列，来研究NOS终止子是否位于Bt cryIA(b)和cryIA(c)融合基因的后部，确证是否符合已有研究中对pFHBT1结构的描述

17、。使用样品FR0502519与FR0502520的DNA，使用在cryIA(c)基因与NOS终止子上的引物对进行PCR扩增(参见Fig.1)。测序结果显示两个大米调查样品的序列没有差异(见Fig. 3)，序列中含有cryIA(c)基因与NOS终止子基因。Bt大米品系结构特异性的检测为了检测中国可能商品化的所有利用质粒pFHBT1转化的Bt转基因大米，我们决定建立结构特异性的检测方法来代替基因特异性的方法。在两个大米样品的基因序列的基础上，针对cryIA(c)基因与NOS终止子之间的序列建立了PCR检测体系（见Fig. 3）。使用从转基因植物参考物质（LL RICE62大米、GTS40-3-2大

18、豆、T25、Bt11、Bt10、Bt176、MON810、MON863、NK603、TC1507、GA21与CBH351玉米）和传统大米中提取的10ng100ng DNA用来检测PCR体系的特异性，上述的DNA对于Bt大米PCR检测体系都为阴性（检测资料未显示）。灵敏度与检测限值Bt大米的real-time PCR方法的检测限值的测定通过使用DNA的系列稀释液，直到得到PCR阴性检测结果（Table 2）。估计一个大米单倍体基因拷贝的分子质量约为0.47pg，Bt转基因大米结构特异性检测体系的检测限为7个拷贝。使用各稀释度的平均Ct值可以建立相应的回归曲线（Fig. 4）。为了建立可以相对定量的检测方法，将Bt大米结构特异性PCR检测体系与特异性分类基因的real-time PCR检测体系进行了结合。目前已经有两个分别检测大米内源基因的real-time PCR进行了报道20,21。sps PCR体系的检测限为10 个基因拷贝20。gos9 PCR体系的检测限为3 个基因拷贝21。我们将两个方法进行了比较，结果显示gos9 PCR体系比sps PCR体系灵敏度更高，对于相同量的模板DNA，gos PCR体系扩增曲线出现时要比sps体系提早出现5个Ct值。因此，本研究采用gos9 PCR体系来检测大米内源性基因，并建立real-time PCR体系对Bt 大米进行检测。B