仪器分析：色谱分析法理论基础

1、色谱分析法理论基础色谱分析法理论基础 色谱法早在色谱法早在19031903年由俄国植物学家年由俄国植物学家分离植物色素时采用。后来分离植物色素时采用。后来不仅用于分离有色物质，还用于分离不仅用于分离有色物质，还用于分离无色物质，并出现了种类繁多的各种无色物质，并出现了种类繁多的各种色谱法。许多气体、液体和固体样品色谱法。许多气体、液体和固体样品都能找到合适的色谱法进行分离和分都能找到合适的色谱法进行分离和分析。析。 目前色谱法已广泛应用于许多领域，成为十分重要的目前色谱法已广泛应用于许多领域，成为十分重要的分离分析手段。但不管属于哪一类色谱法，其共同的分离分析手段。但不管属于哪一类色谱法，其共

2、同的基本特点是具备基本特点是具备两个相：两个相： 不动的一相，称一为不动的一相，称一为固定相固定相； 另一相是携带样品流过固定相的流动体，称为另一相是携带样品流过固定相的流动体，称为流动相流动相。 当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中

3、流出。从而按先后不同的次序从固定相中流出。色谱法分类 1.1.按两相状态分类按两相状态分类气体为流动相气体为流动相的色谱称为的色谱称为气相色谱（气相色谱（GC),GC),根据固定相是固体吸附根据固定相是固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体），又可分为体），又可分为气固色谱（气固色谱（GSCGSC）气液色谱（气液色谱（GLCGLC）液体为流动相液体为流动相的色谱称的色谱称液相色谱（液相色谱（LC),LC),同理，液相色谱亦可分为同理，液相色谱亦可分为液固色谱（液固色谱（LSCLSC）液液色谱（液液色谱（LLCLLC）超临界

4、流体为流动相的色谱称为超临界流体色谱（超临界流体为流动相的色谱称为超临界流体色谱（SFCSFC）。）。一、一、 流出曲线及有关术语流出曲线及有关术语 在气相色谱分析法中，在气相色谱分析法中，将以将以组分浓组分浓 度为纵坐标，度为纵坐标， 流出时间为横坐标，绘流出时间为横坐标，绘得的组分及其浓度随时得的组分及其浓度随时间变间变 化的曲线称为色谱化的曲线称为色谱图，也称色谱流出曲线。图，也称色谱流出曲线。下面是单个组分的色谱下面是单个组分的色谱图，用以说明图，用以说明 色色 谱分析法的相关术语。谱分析法的相关术语。 基线和保留值基线和保留值 1. 基线：图中的基线：图中的O t 表示表示只有载气通

5、过只有载气通过检测器时响应信号检测器时响应信号的记录。在条件稳的记录。在条件稳定时为一直线。定时为一直线。2. 保留值保留值：表示试：表示试样中各组分在色谱样中各组分在色谱柱内停留的时间数柱内停留的时间数值值。通常用。通常用时间时间或或相应的相应的载气体积载气体积来来表示。表示。（1）用时间时间表示的保留值 保留时间保留时间 tR：指：指待测组分从进样到待测组分从进样到柱后出现浓度最大柱后出现浓度最大值时所需的时间值时所需的时间, 如如图中的图中的O B。 死时间死时间tM：指：指不不与固定相作用的气与固定相作用的气体（如空气、甲烷体（如空气、甲烷等）的保留时间，等）的保留时间，如图中如图中O

6、A所示。所示。（1）用时间时间表示的保留值（二）_ 调整保留时间调整保留时间 t R：指指扣除了死时间的保留扣除了死时间的保留时间时间，如图中的，如图中的AB。 即：即：tR = tR tM 注意：当固定相一定，注意：当固定相一定，在确定的实验条件下，在确定的实验条件下，任何物质都有一定的保任何物质都有一定的保留时间，它是色谱分析留时间，它是色谱分析法的基本参数。法的基本参数。 保留体积VR：指从进样到柱后出现待测组分浓度极大值时所通过的载气体积。 VRtR F0 F0 色谱柱出口处载气流速 （mL/min） 死体积死体积V VM M：指：指色谱柱内色谱柱内除了填充物固定相以外除了填充物固定相

7、以外的空隙体积、色谱仪中的空隙体积、色谱仪中管路和连接头间的空间管路和连接头间的空间及检测器的空间的总和。及检测器的空间的总和。 V VM Mt tM MF F0 0 调整保留体积调整保留体积VVR R：指扣除了死体积后：指扣除了死体积后的保留体积。的保留体积。（2）用体积表示的保留值用体积表示的保留值3. 相对保留值相对保留值相对保留值 r21： 指组分2和组分1调整保留值之比，是一个无 因次量。 r21 = tR2 /tR1 = VR2 /VR1 注意：注意：相对保留值只与柱温及固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了色谱柱对这两种组分的选择性。4. 区域宽度（一）区域宽度（一）（

8、1）标准偏差标准偏差： 1/2EF1/4IJ（1/4Wb） 即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。 峰高 h 是色谱峰顶到基线的距离。h、是描述色谱流出曲线形态的两个重要参数 。 h 、与的关系如何？ 即色谱峰宽度。习惯上常用以下三个量三个量来表示。区域宽度（二）区域宽度（二） （2）半峰宽半峰宽Y1/2: 峰高一半处峰高一半处色谱峰的宽度色谱峰的宽度。如图中的GH。 半峰宽与标准偏差的关系为：注意注意：由于半峰宽容易测量，使用方便，所以一般用它来表示区域宽度。354. 22ln22Y2/1区域宽度（三）区域宽度（三）（3）峰基宽度峰基宽度Wb：即：即通通过流出曲线的拐点所作的过流出曲线的拐点

9、所作的切线在基线的截距，切线在基线的截距，如图如图I J所示。所示。Wb与与的关系：的关系： Wb 4二二 色谱法中的主要参数和关系式色谱法中的主要参数和关系式分配系数分配系数Kp和容量因子和容量因子K （1）分配系数分配系数Kp：定温定压下物质在固定相和流动相中的：定温定压下物质在固定相和流动相中的浓度比。浓度比。 KPCs / Cm （s固定相；固定相； m流动相）流动相） （2）容量因子容量因子K：分配系数与两相体积有关的参数，表示：分配系数与两相体积有关的参数，表示溶质溶质A在两相中的质量之比。在两相中的质量之比。 K=mAs / mAm =KPVS/Vm分配系数分配系数Kp和体积保留

10、值和体积保留值VR的关系的关系VR = VM + KpVs 即：即：VR = VM（1+ K） 或：或：K（VRVM）/ VM当流动相流速一定时有：当流动相流速一定时有： K（tRtM）/tM tR/tM 从上两式可以看到，色谱分析法中各组分保留值从上两式可以看到，色谱分析法中各组分保留值随随K 而变化，而而变化，而tM 、tR都可以从色谱图上测得，从都可以从色谱图上测得，从而可以求出而可以求出K。容量因子。容量因子K是描述溶质保留行为的一是描述溶质保留行为的一个重要参数。个重要参数。（3）分离比分离比a 色谱分析法中A、B两种物质的分离效率可用分离比表示。当两相体积一定时，分离比与保留值的关

11、系为： aKp(B)/Kp(A)K(B)/K(A)tR(B)/ tR(A)B，A 在色谱法中，分离比等于被分离两种物质分离比等于被分离两种物质的调整保留值之比。的调整保留值之比。 tR(B)/ tR(A)B，A也称相对保留值。也称相对保留值。三、三、 色谱柱的效能塔板理论色谱柱的效能塔板理论 在50年代，色谱技术发展的初期，Martin等人把色谱分离过程比作分馏过程，并把分馏中的半经验理论塔板理论用于色谱分析法。 色谱柱的效能塔板理论（二）色谱柱的效能塔板理论（二） 这理论把色谱柱比作一个分馏塔，假设柱内有这理论把色谱柱比作一个分馏塔，假设柱内有n个塔板，在每个塔板高度间隔内，试样各组分在两相

12、个塔板，在每个塔板高度间隔内，试样各组分在两相中分配并达到平衡，最后中分配并达到平衡，最后,挥发度大的组分和挥发度小挥发度大的组分和挥发度小的组分彼此分离，挥发度大的最先从塔顶（即柱后）的组分彼此分离，挥发度大的最先从塔顶（即柱后）逸出。尽管这个理论（概念）并不完全符合色谱柱的逸出。尽管这个理论（概念）并不完全符合色谱柱的分离过程，色谱分离和一般的分馏塔分离有着重大的分离过程，色谱分离和一般的分馏塔分离有着重大的差别，但是因为这个比喻形象简明，因此几十年来一差别，但是因为这个比喻形象简明，因此几十年来一直沿用。直沿用。 色谱柱的效能塔板理论（三）色谱柱的效能塔板理论（三） 按照塔板理论，色谱柱

13、的分离效能可以用按照塔板理论，色谱柱的分离效能可以用塔板数塔板数来表示，由塔板理论导出的来表示，由塔板理论导出的理论塔板数理论塔板数 n 的计算公式是：的计算公式是： n=5.54(tR/y1/2)216(tR/Wb)2 注：使用该公式，注：使用该公式，分子分母应取相同单位分子分母应取相同单位。色谱柱的效能塔板理论（四）色谱柱的效能塔板理论（四） 由于死体积由于死体积V VM M ( (或死时间或死时间t tM M) )内并没有发生分配作用，内并没有发生分配作用，在考虑柱的实际分离效能时应予扣除，在考虑柱的实际分离效能时应予扣除，扣除死时间后色谱扣除死时间后色谱柱效用柱效用有效塔板数有效塔板数

14、n n有效有效 和有效塔板高度和有效塔板高度H H有效。有效。2)(16)Yt(54. 5n221RbR/Wt有效H有效L / n有效 由于同一色谱柱对不同物质的柱效能不同，故用由于同一色谱柱对不同物质的柱效能不同，故用H H、n n、H H有效、有效、n n有效有效等指标表示柱效能时应注明被测物质和色等指标表示柱效能时应注明被测物质和色谱条件。谱条件。色谱柱的效能塔板理论（五）色谱柱的效能塔板理论（五）22)1(16n2121rrR有效n有效有效也可以用下式表达：也可以用下式表达：)1(162121rrnR有效n有效有效与与R的关系式为的关系式为：有效HrrRL22)1(162121柱长柱长

15、符号与上面讨论的相同。符号与上面讨论的相同。色谱柱的效能塔板理论（六）色谱柱的效能塔板理论（六） 理论塔板高度理论塔板高度（H）：H L / n L 色谱柱长度色谱柱长度 n n 大或大或 H H 小，表示柱的分离效能愈高。小，表示柱的分离效能愈高。 有效塔板数（高度）：扣除了死体积或死有效塔板数（高度）：扣除了死体积或死时间后的塔板数（高度）。色谱柱内的死时间后的塔板数（高度）。色谱柱内的死体积或相应的死时间实际上并没有参与分体积或相应的死时间实际上并没有参与分配作用。配作用。 四、四、 影响色谱柱效能的因素影响色谱柱效能的因素速率理论（一）速率理论（一） 前面已知，用塔板理论来说明色谱柱内

16、各组前面已知，用塔板理论来说明色谱柱内各组分的分离过程并不合理，因为色谱柱内并没有分的分离过程并不合理，因为色谱柱内并没有塔板。当同一试样进入同一色谱柱，当流动相塔板。当同一试样进入同一色谱柱，当流动相速度变化时，得到不同的色谱图。测得的速度变化时，得到不同的色谱图。测得的 n n 和和 H H 也不同，充分说明塔板理论不足以说明色谱也不同，充分说明塔板理论不足以说明色谱柱的分离过程。柱的分离过程。影响色谱柱效能的因素影响色谱柱效能的因素速率理论（二）速率理论（二） 1956年，荷兰学者范德姆特（年，荷兰学者范德姆特（VanDeomter）等提出一个描述色谱柱分离过程中复杂因素使色等提出一个描

17、述色谱柱分离过程中复杂因素使色谱峰扩宽而致柱效降低（即：使谱峰扩宽而致柱效降低（即：使 H 增大）影响的增大）影响的方程。此方程经简化后写为方程。此方程经简化后写为:UDUCUB/ AH该式称为速率方程（范氏方程范氏方程）。 下面我们将对公式中的各项进行讨论下面我们将对公式中的各项进行讨论 影响色谱柱效能的因素影响色谱柱效能的因素速率理论（三）速率理论（三） A 涡流扩散项, 反映溶质分子受固定相颗粒障碍改变移动方向，形成涡流引起扩散。与填充颗粒的大小及填充的均匀性有关，而与流动相的流速无关。A越大，色谱峰变宽更严重。 式中 ； 流动相的平均线速度 UDUCUB/ AH（范氏方程）。影响色谱柱

18、效能的因素影响色谱柱效能的因素速率理论（四）速率理论（四）v由于由于溶质区带前后存在着浓度差，因而产生纵溶质区带前后存在着浓度差，因而产生纵向扩散使区带（色谱峰）扩宽向扩散使区带（色谱峰）扩宽。由于分子在液体。由于分子在液体中的扩散速率大约是在气体中的中的扩散速率大约是在气体中的 1/105，所以该，所以该项项对液相色谱来说很小，对液相色谱来说很小，而对气相色谱则很重要。而对气相色谱则很重要。v扩散的严重与否，扩散的严重与否，关键是取决于流动相的线速关键是取决于流动相的线速度。度。速率方程（范氏方程）UDUCUB/ AH：分子扩散项UB/ 影响色谱柱效能的因素影响色谱柱效能的因素速率理论（五）

19、速率理论（五） 此两项对色谱峰的影响均与流速成正比。在流速很此两项对色谱峰的影响均与流速成正比。在流速很高的情况下，由于没有足够的时间建立平衡，偏离更为高的情况下，由于没有足够的时间建立平衡，偏离更为严重。严重。C 固定相传质阻力项固定相传质阻力项 D 流动相传质阻力项流动相传质阻力项 (非平衡状态作用非平衡状态作用) 对于一定的色谱体系，速率方程中对于一定的色谱体系，速率方程中A、B、C、D其其值为一定。速率方程描述了流动相的平均线速度对柱值为一定。速率方程描述了流动相的平均线速度对柱效能的影响。效能的影响。影响色谱柱效能的因素影响色谱柱效能的因素速率理论速率理论(六六) 固定填充柱，对某一

20、固定填充柱，对某一物质在不同的载气流速物质在不同的载气流速下下,测定塔板高度，即可测定塔板高度，即可作右图。作右图。从图中可以看出，从图中可以看出，曲线最曲线最低点处低点处 H 最小，即柱效能最小，即柱效能最高，该点对应的载气流最高，该点对应的载气流速为最佳流速。速为最佳流速。 上述做法可用来求上述做法可用来求某条件某条件下对某种物质的最佳载气下对某种物质的最佳载气流速。流速。 H 的关系如下图所示的关系如下图所示气相色谱分析法中，气相色谱分析法中，五、五、 分离效率的表示方法分离度分离效率的表示方法分离度 分离效率的表示方法分离效率的表示方法 分离度（分辨率）分离度（分辨率） 一个混合物（设

21、只有一个混合物（设只有A、B两种组分）经色谱分离两种组分）经色谱分离后，得到的谱图可能为：后，得到的谱图可能为：试评价（试评价（1）（）（2）（）（3）的分离效果。）的分离效果。（考虑两方面因素：溶质的保留值和溶质区带的区域宽度）（考虑两方面因素：溶质的保留值和溶质区带的区域宽度）色谱分离效率用参数分离度（分辨率）色谱分离效率用参数分离度（分辨率）R来表示。来表示。分离效率的表示方法分离度（一）分离效率的表示方法分离度（一）色谱分离效率用分离度（分辨率）色谱分离效率用分离度（分辨率）R来表示：来表示：v式中：分子反映了溶质在两相中分配行为对分离的影响，式中：分子反映了溶质在两相中分配行为对分离的影响， 是色谱分离的热力学因素。是色谱分离的热力学因素。v分母反映了动态过程溶质区带的扩宽对分离的影响，是分母反映了动态过程溶质区带的扩宽对分离的影响，是 色谱分离的动力学因素。色谱分离的动力学因素。v从中得到：从中得到：两溶质保留时间相差越大，色谱峰越窄，分两溶质保留时间相差越大，色谱峰越窄，分 离越好。离越好。)(699. 1)( 2)( 2/ 1)(2/1)(2/1)()()()()()(BAARBRBbAbARBRYYttRWWttR或分离效率的表示方法分离效率的表示方法分离度（二）分离度（二） 对于两个面积相等的对称峰，理论上可以证明： R 0.8 1.0 1