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文档简介
1、种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体及其制备方法1"一种聚苯乙烯甚质檢嚴固和有机合成栽体*耳特tit在于.它绘将齟甲基聚苯乙烯莪体与3-輒亦1«4、-二甲氧三苯甲基卜12丙二醉通过號旳幡驢偶联得到的固相朝偽具有如下结构式:英中.PS为聚苯乙烯找体,DMT为4彳-二甲软三苯甲莖.2-艸聚基乙烯華质核啟固相有机合成载体的制备方法,包含如卜涉骤:在沐度为0.l-5.0mnioVg的催叱剂存在条件下,聚苯乙烯義体与忖隸甲基邻苯二甲離亚陵在有机澹液中反应,得到邻苯二甲酰亚胺甲砥聚苯乙烯載体;小郭苯一甲酰亚肢甲基聚睾乙擁鞍体邛報用为?30%胖的乙醉髀液中反应.得到氨甲苹聚苯乙烯载体*U甲
2、星聚苯乙烯载体与琥旳酸酊在有机溶液中反应得到琥珀酰胺甲基聚縈乙烯载体*(d) <QM用痕丨.琥用醜胺甲赫苯ZJMt体与3-氨墓彳4*仁_甲氧三笨田基H2-丙二辞间臂在浓度为i-JOmmoVgl+的催化刑催化F于室温反应,得到如权利聲求I所述聚苯乙烯基质核酸固相有机含成栽体.二如权利姿求2所述的制冬方法,具中所慢用的有机溶刑为一凱甲住“期氢咲喃、MbT-二甲甚甲醸胺、乙聃、三乙胺、毗咗、2上二甲基毗喘中的一种或几种的混合溶剂.4如权和要求2所述的制备方法.其中所使用的冇机涪剂的嚴为2100mL,更优选的是4. 5<hnL=5. 如权利要求2所述的制备方法,其中的反应时问为278h,更
3、优选的是224爪6. 如权利亞求2所逑的制备方法,其中的反应温浚为室温80©7. 如叔利要求2所述的制备方法步鎳Ca)所锲出的聚苯乙烯载体DWi交联度为15%.鬼优选的是1怖孑僵如权利要求2所述的制無方注步驟(G所便用的聚苯乙堺載休粒径范围为20】OOgm也优选的是m卜hoc屮m9, 如杞利要求2所述的制备方法,步驟5所使用的催化剂是甲基硝酸、図猛化锡、包範酸.二瓠化钦、二氯化tv二苓甲銅、砒基甲烷中的种*10. 如权利豐求2所込的制备方法步骥(3)所便用的催化剂的用星为0.l-5.Qnunol/E体,更优选的是0.2-2.0mmol/g载体。1】.如权利耍求2所述的制备方法,步骤(
4、a)所使用的N氯甲基邻苯二甲酰亚胺的用量为0.25.0mmol/g朝体,更优选的是0.52.0mmol/g载体.12.如权利要求2所述的制备方法,步骤(b)所使用的腓的乙醇溶液的浓度为330%,更优选的是5%15%.如权利要求2所述的制备方法,步骤(b)所使用的腓的乙肿溶液的用毎为550mL/g载体,更优选的是10-25mL/g体.14如权利雯求2所述的制备方法,步骤(c)所便用的琥珀酸軒的用量为0.510nunol/g载体,更优选的是l5mmol/g载体。】5如权利娶求2所述的制备方法,步骤(d>所使用的3気基-1<4,4-二甲氣三苯甲基)1,2丙二醉间借的用屋为0.5lOmmo
5、l/g祓体,更优选的是l5mmol/g我体。16. 如权利要求2所述的制备方法,步骤(d)所使用的備化剂种类为1疑基苯并三畔、N.N*二环己基碳二亚胺、N,NT二异丙菇碳二亚胺中的一种或几种的混合物.17. 如权利要求2所述的制备方法,步骤(d)所使用的催化剂的用量为I10mmo"g载体,更优选的是25mmol/g载体。1&如权利要求1所述的核駿固相有机合成载体,其特征在于,所述的载体载呈大于60pmol/g,偶联效率大于95%19.如权利要求1所述的核酸固相有机合成载体,其特征在于,所凤的载体能够満足不同序列孩酸合成的需要,是一种通用型的聚苯乙烯基质核酸固相有机合成戏体。一
6、种聚苯乙妳基质核酸固相有机合成较体及其制备方法技术领域克发明涉及核酸固相有机報体及其制备方法,更具体的说,趕涉及一种通用空聚苯乙烯基质核酸固相有机合成教体及其制备方法。背景技术核酸固相有机合成足将固相合成和亚磷战胺浓相结合,借助于商品化的DNA/RNA合成仪(如ABI公司的392DNA/RNA合成仪或GE公司的KTAoligopilotDNA/RNA合成仪),在固相较休上依次按曲核酸序列进行偶联.实现快連.高效、稳定的核酸合成.由于囲相有机合成貝有自动化程度高、产物金大、没有序列限制、合成产物易进行化学修饰等优点,因此足目前获得人量核酸最主要的途径之一.目前大多数核酸固相載体均是在可控孔度玻璃
7、(CPG)載体上连接目标核酸的起始核昔单体,以此提供核酸序列桁生的活性位点,在此基础上依次进行目标序列的合成,如Sigma公可的核酸合成系列我体就是将CPG与核昔单体通过琥珀酸健连接得到的,CPG上核昔单体作为合成核酸序列的起始核昔.除琥珀酸键外,还有一些化学间骨也能用于连接CPG和起始孩昔单体,如Ahil和Pon分别采用乙二酰键和对苯二酚O,CT乙酰乙酸卑作为连接间習,得到了不同的CPG固相有机合成找体(Alul.NucleicAcidsRcscarch(19):1527(1991):Pon.NucleicAcidsResearch(25):3629-3635(1997)#CPG作为一种无机
8、硅氧基载体,具有表面易衍生、反应活性较高、不溶胀等优点,但由于其表面富含胫基,亲水性较强,且其保护基在合成过程中易脱落,定程度上影响了核酸的合成效率和质就.此外,传统的固相载体根据连接的起始孩甘(A、T、C、G、U)分为不同的那矣.耍満足不同序列的合成要求需备齐全部种类的固相载体.提高了试验成本和工作蜃。聚苯乙烯(PS)是一种性能优异的有机载体,McCollumC等利用甲基聚苯乙烯偶联核昔单体琥珀駿衍牛物作为固相有机合成战体进行DNA的合成,取得了较好的合成效果(McCollum,TetrahedronLcttcre32:4069-4072(1991)聚苯乙烯表面疏水,通过无水溶剂的淋洗能够彻
9、底除去我面的殘留水分,减少水分对孩酸合成的干扰.其表血经过氨基衍生后活性位点相对较少,核酸合成过程中不易产生错误序列,产物纯度较閒.针对传统载体芳分类的问题,Lyttle等开发了一类以CPG为基质的通用較体,它仅提供孩酸合成的位点(活性咒基)而不连接足始核音,能够满足不同核酸序列合成,解决了固相载体分类的麻烦(Lylllc.NucleicAcidsResearch24:2793-2798(1996)Nelson等也开发了一种名为“Rainbow”的通用CPG截体,合成性能也相当优异(Nelson,BioTechniques22:752-759(1997)本发明将氨甲基聚苯乙烯与3-氮基-1-(
10、4,4*-甲氧三覃屮基)1,2.丙二醇通过琥珀酸键连接,制备了一种通用型的聚苯乙烯基质核酸固相有机合成戟体。发明内容本发明的日的在于提供一种核酸固相有机合成戏体.本发明的目的还在于提供一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体,它载虽奇于传统载体,能够满足各种核酸序列的合成需雯,具有较好的合成性能。本发明的目的还在于提供一种核酸固相有机合成载体的制备方法。本发明的冃的还在于提供一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体的制备方法.本发明握供的聚苯乙烯基质核酸固相有机合成栽体,它足将氨甲基衍生的聚苯乙烯载体通过琥珀酸键与3氮Jt-l-(4,4*-二甲氣三苯甲M)-l,2-丙二肿偶联徇到的固相载体。载体的载虽
11、大于60Pmol/g载体,合成反应中毎步偶联效率大于95%.同时,它具有通用性,能够满足各种核般序列的合成需要。本发明还提供了一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体的制备方法,包括以卜涉骤:(a) 在浓度为0.15.0mmol/g载体的催化剂存在条件下,聚苯乙烯我体与N氯甲基邻苯二甲酰亚胺在有机溶液中反应,得到邻苯二甲酰亚胺甲產聚苯乙烯载;体;(b) 邻苯二甲酰亚胺甲基聚苯乙烯戦体在浓度为330%脐的乙俾溶液中反应,得到氨甲基聚苯乙烯较体;(c) 氨甲基聚苯乙烯载体与琥珀酸酊在有机溶液中于宅温反应,得到琥珀酰胺甲基聚苯乙烯我体:(d) 在有机溶液中,琥珀醸胺甲基聚苯乙烯载;体与3-氨基-1-(4
12、,4,.二甲氧三苯甲基卜12丙二醉间臂在浓度为110mmol/g戟体的催化剂催化下于室温反应,得到所述核酸固相有机谷成载体。上述制备方法中,所使用的聚苯乙烯载体二乙烯基苯交联度为0.5%15%,更优选的圧1%3%;我体粒径范围为20lOOOym,更优选的是30300pm;所使用的有机溶剂为二氯甲烷、四氢咲喃、N,N»二甲基甲酰胺、乙席、三乙胺、毗碇、2,6二甲基毗碇中的一种或几种的混合溶剂:有机溶剂的用虽2lOOmL,更优选的足450mL:反应时间为278h,更优选的是224h:反应温度为室温-80*C.上述制备方法中,步骤(a)中所使用的催化剂为甲基硕酸、四氯化锡、氢氟酸、三氯化铁
13、、三氯化铁二苯甲酮、歸基甲烷中的一种:催化剂用虽为0.15.0mmol/g载体,更优选的是0.22.0mmo"g载体;N氯甲基邻苯二甲酰亚胺的用最为0.25.0mmol/g载体,史优选的是0.52.0mmol/g载体.匕述制备方法中,步骤(b)中所使用的耕的乙醇溶液的浓度为330%,更优选的足5%15%:用斌为550mL/g载体.更优选的是1325mL/g馥体.上述制备方法中,步骤(c)中琥珀酸fiT的用量为0.5lOmmol/g载体,更优选的足卜5mmo"g载体。上述制备方法中,步骤(d)中我体与间習偶联时,3.氨.基亠(4/T二甲氧三苯甲基)4,2丙二醇间臂的用虽为0.
14、5-!0minul/g体,吏优选的足15mmol/g载体;反应所用的催化刑为1劣基苯并三哇、N,N'二环己基碳二亚胺、N,N,二异丙基碳二亚胺中的一种或几种的混合物:催化剂用最为110n】mol/g载体,更优选的是25mmol/g载体.本发明公开的制备方法与现有技术相比,具有如下优点:L本发明提供了一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体的制备方法,并得到了-种合成性能优良的聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体。2. 本发明制备的聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体裁量大于60Mmo1/g,高于传统载体3. 本发明制备的聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体能够满足各种核酸序列的合成需要,具有通用性.4
15、. 本发明的操作方法简单易行,反应条件温和,易于工业化的放大生产。具体实施方法下面结合实施例对本发明作进一步的描述,但本发明并不仅仅限制于该实施例中.实施例丨5.0g3-氨基-1,2丙二醇加入50mL三氟乙酸甲酯中,爼温搅拌反应24h,反应结束后蒸憶除去三氛乙酸甲酯,得油状产物3三氟乙酰K-L2-丙二醇,产物经红外检测结构正确,离子阱质谱检测分子量为187.2,与理论值相符。3.0g3-三氟乙酰胺1.2丙二醇加入50mL毗曉中,搅拌同时加入4.5gDMT-CI,室温搅拌反应8h,加入2mL甲醇终止反应。蒸憎除去溶剂,产物用硅胶柱色谱纯化得到淡黄色油状产物3三氟乙酰胺-l-DMT-1,2-丙二醇
16、,产物红外检测结构正确,离子阱质谱检测分子最为489.1,与理论值相符.2.5g3三氟乙酰胺亠(4,4-二甲氣三苯甲基).1,2内二酢溶于1OOmL6M氨的甲醉溶液中,室温搅拌反应10h,煤卡得无色油状产物3.氨基-l-DMT-1,2-,收率90%,HPLC检测纯度为96.5%,产物红外检测结构正确,离子阱质谱检测分子量为393.2,与理论值相符.实施例2称取l.Og聚苯乙烯载体(二乙烯基苯交联度为2%,粒径为3080pm),0.15gN-氯甲基邻苯二甲酰亚肢,20mL二氣甲烷加入茄形瓶中.搅拌加入200mg三氯化铁作催化剂,25*C搅拌反应15h.反应结束后.分别用二氯甲烷(5X10mL),
17、甲W(2X10mL)淋洗载体,真空干燥2h,将干诛后的取体加入10mL10%耕的乙醇溶液中,回流反应7h,然后用乙fi$(5X10mL)淋洗,曳空干燥得氮甲基衍生的聚苯乙烯载体.红外检测我体结构正确,水杨醛法测载体氮基载皐为0.48mmol/g载体实施洌3称取2.5g聚苯乙烯载体(二乙烯基苯交联度为1.5%,粒径为80120pm),2.0gN-氯甲基邻苯二甲酰亚胺,80ml,二氯甲烷加入茄形瓶中,加入0.5mL甲基磺酸作催化剂,60*C搅拌反应I0h反应结束后,分别用N,N,二甲基甲酰胺(3X10mL),甲W(2X10mL)淋洗载体,克空丁燥2h将干燥后的戦体加入50mL12%耕的乙醇溶液中,
18、回流反应10h,然后用乙醉(3X10mL),甲fi?(3X10mL)淋洗载体,真空干燥得氨甲基衍生的聚苯乙烯载;体.红外检测载体结构正确,水杨醛法测载体氨基载呈为0.89mmol/g载体.实施例410g氨甲基聚苯乙烯,5.0g琥珀酸軒,l5mL毗陀混合,室温振荡24h,須到琥珀酰胺甲基聚苯乙烯载体。干燥后的载体与2.0g3-氨基-1-DMT-L2-丙二醇0.8g1胫基苯并三咯10mL2,6二甲基毗咤混合,室温振荡48h;过滤收集我体,頁空干燥干燥后的载体悬浮于30mL四氢咲喃中,加入5mL甲酸和3mL乙酸时泯的合物(3h内加三次,每次1.5mL)进行甲酰化,家温振荡8h:用20mL乙月青淋洗载
19、体,真空干燥2h,得所需的核酸固相有机合成较体.分光光度法检测DMT载量为128.75nmol/g,实施例52.0g氨甲基聚苯乙烯,4.0g琥珀腹軒,25mL毗剜昆合,室温振荡过夜,得到琥珀酰胺甲基聚苯乙烯载体.干燥后的载体与5.0g3.艮基丙二职3.0gN,Z二异丙基碳二亚胺,50mL毗碇混合,室温振荡36h;过滤收集载体,真空干燥2h。2.0g我体悬浮于30mL毗碇:四氢咲喃(3:4)中,加入10mL甲酸和6mL乙酸酹泡的合物(5h内加三次,每次3mL)进行甲酰化,室温振荡12h;用30mL四氢吠喃淋洗载体,真空干煉2h,得所需的核酸固相有机合成载体。分光光度法检鴻DMT载启为85.36p
20、mol/g实施例6利用例4中御到的聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体,合成寡核昔酸片段5'AUUGGCCAUGCUA:F,按照35,的顺序依次在载体上偶联核昔亚确酰胺单体,合成规模为】屮nol,每个偶联循环操作步骤为:(a)DMT保护基的脱除:反应询,使用无水乙脂充分洗涤反应仪器和固相皴体,然后加入0.7mL2%三氯乙酸的二氯甲烷溶液,反应60s,使用无水乙睛洗涤除去三氯乙酸和水;(b)偶联反应:将lOOpLO.lmmol/mL亚磷酰胺单体溶液和)L5乙硫基四氮哇溶液加入反应器中,反应15min,反应结東后固相载体用无水乙瞒洗涤;(c)封闭反应:加入1001.16%N-甲基眯畔的四氢咲喃溶液和lOOpL10%无水乙酸肝,10%唏喘的四氢咲喃溶液,反应5s:(d)氧化反应:加入0.5mL碘氧化溶液,反应45s,将亚磷酸三酯氧化为稳定的磷酸三酯,结束本偶联周期.貳复偶联步骤直至完成核酸片段的合成。合成结束后,取出载体,加入2M氨的甲醉溶液,20*0反应lh,将产物从我体上切割,后加
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