丝氨酸羟甲基转移酶催化合成L-丝氨酸项目介绍

1、丝氨酸羟甲基转移酶催化合成丝氨酸羟甲基转移酶催化合成L-丝氨酸项目介绍丝氨酸项目介绍 南京拓欧生物科技有限公司南京拓欧生物科技有限公司 刘 志 斌南京拓欧生物科技有限公司简介南京拓欧生物科技有限公司简介公司宗旨公司宗旨: 以生物催化技术为核心，包括一系列生物酶在大肠杆菌和酵母中的高效表达以及生物酶的合理设计和定向进化改造，结合有机合成技术，系统开发市场上重要的手性药物关键中间体及其相关原料药。其独有的生物酶技术将使得某些产品填补国内空白或者其产品质量和生产成本有重大改进。公司主要负责人公司主要负责人: 刘志斌刘志斌，新加坡科技局化学工程研究所研究员。自1997年起，中国南京工业大学制药与生命科

2、学学院工作。于2002-2003在德国法兰克福马克斯普郎克生物物理所访问进修一年后，2004年加入欧洲著名的应用生物催化剂研究中心（Research Center of Applied Biocatalysis, Graz), 主持并参与多项企业合作项目，获得多项专利成果。2007年加入新加坡化学工程研究所。主要研究方向：手性医药农药中间体的酶催化合成。负责公司的产品研发，项目实施和协调管理。 刘经辉，刘经辉，南京长澳制药有限公司物控部经理，负责项目实施和协调管理。丝氨酸羟甲基转移酶催化合成丝氨酸羟甲基转移酶催化合成L-丝氨酸项目简介丝氨酸项目简介国内外技术发展及生产现状国内外技术发展及生产现

3、状 L-丝氨酸的生产方法有蛋白质水解法、 发酵法和酶法，目前主要是发酵法和酶法。 蛋白质水解法：蛋白质水解法：因其操作复杂和产品分离精制困难而不再作为L-丝氨酸生产的主要方法。发酵法：发酵法：主要是基因工程菌发酵法，都存在携带目标基因的质粒稳定性差,发酵周期长（72小时）、产酸率低（50克/升）和收率低等缺点。酶法：酶法：酶法生产L丝氨酸采用丝氨酸羟甲基转移酶催化甘氨酸和甲醛特异性地合成L-丝氨酸，因其具有原料价格低且来源方便、积累的产物浓度高、纯化步骤少、生产能力强等优点，是目前国内L丝氨酸的主要生产路线。+酶甘 氨 酸磷 酸 吡 哆 醛四 氢 叶 酸甲 醛L-丝 氨 酸项目已达到的技术水平

4、及创新点（一）项目已达到的技术水平及创新点（一）丝氨酸羟甲基转移酶的高密度发酵生产。 丝氨酸羟甲基转移酶：丝氨酸羟甲基转移酶：来源于嗜热菌，具有一定的热稳定性，可以在较高温度下进行酶转化（高温下酶转化有助于抑制菌体丝氨酸降解酶活性）。高密度发酵培养基：高密度发酵培养基：使用廉价的无机培养基（无机盐 + 碳源 + 诱导剂），使用的有机氮源仅为0.5克/升，大幅度降低发酵成本（与国内工艺路线相比），同时带入酶转化步骤的杂质少，便于产品提取纯化。传统工艺使用大量的葡萄糖和有机氮源。高密度发酵工艺：高密度发酵工艺：在简单的两步法（初始培养和诱导培养）发酵工艺条件下，能很容易地实现高密度培养和酶的高效表

5、达。因为使用无机培养基，发酵工艺容易掌握且重复性好。项目达到的技术指标：项目达到的技术指标：在5升发酵罐上验证，细胞湿重约100100克克/ /升升；丝氨酸羟甲基转移酶活性160 160 单位单位/ /毫升毫升（每毫升细胞裂解液每分钟转化甘氨酸生成的L-丝氨酸的微摩尔数）。项目已达到的技术水平及创新点（二）项目已达到的技术水平及创新点（二）含丝氨酸羟甲基转移酶的细胞的处理：将细胞中丝氨酸降解酶活性失活且增加细胞通透性。 细胞的收集：细胞的收集：可以使用陶瓷膜收集。细胞的处理：细胞的处理：将细胞悬浮在水中进行短时间（4-5小时）的高温处理。细胞是否需要裂解：细胞是否需要裂解：不需要将细胞裂解。将

6、上述得到的细胞悬浮液直接稀释（1/3体积）到转化液中进行后续的酶转化。国内现有工艺是将发酵液浓缩2-3倍后进行转化。单位转化液里使用的细胞量是本工艺的6倍以上。 项目已达到的技术水平及创新点（三）项目已达到的技术水平及创新点（三）酶转化生产L-丝氨酸。 甲醛的添加：甲醛的添加：因为甲醛在转化液中的积累会抑制酶活性乃至使酶失去活性，以pH反馈控制方法缓慢流加可以实现对甘氨酸的高效转化，积累较高的L-丝氨酸浓度以便于后续的产品分离纯化。反应温度和时间：反应温度和时间：50度，约40小时。本项目达到的技术指标及与国内现有工艺的比较本项目达到的技术指标及与国内现有工艺的比较本项目（在1L反应体积上验证

7、7次）国内现有工艺甘氨酸浓度300克/升200克/升对甘氨酸转化80-85%70-75%L-丝氨酸积累300克/升约200克/升单位体积转化液加入的细胞量相当于加入1/3倍体积的发酵液相当于加入2-3倍体积的发酵液L-丝氨酸的提取纯化（一）丝氨酸的提取纯化（一）L-丝氨酸的提取纯化工艺将由横店家园化工和南京拓欧共同开发。目标：L-丝氨酸提取收率达75%。 南京拓欧现尝试的提取工艺：直接结晶法。南京拓欧现尝试的提取工艺：直接结晶法。滤液（残留约24% L-丝氨酸）酶转化液活性碳处理滤液经过两次浓缩结晶L-丝氨酸（约70%收率，含量98%以上）重结晶得到L-丝氨酸（约56%总收率，含量99.6%，

8、旋光：+15.4）L-丝氨酸的提取纯化工艺南京拓欧已有初步结果，但还需要双方共同优化。以目标收率75%来计算，L-丝氨酸的原材料成本为21000 RMB/吨。 0.78 KG L-0.78 KG L-丝丝氨酸氨酸 / KG / KG 甘氨甘氨酸酸0.63 KG L-0.63 KG L-丝丝氨酸氨酸 / KG / KG 甘氨甘氨酸酸L-丝氨酸的提取纯化（二）丝氨酸的提取纯化（二）为进一步提高L-丝氨酸的提取纯化收率，南京拓欧提出一条新思路（未验证）：膜处理。 酶转化液含：细胞碎片，细胞蛋白和酶，辅酶（磷酸吡哆醛和四氢叶酸），甘氨酸和L-丝氨酸细胞蛋白和酶，辅酶（磷酸吡哆醛和四氢叶酸），甘氨酸和L

9、-丝氨酸去除细胞碎片并使转化液澄清去除蛋白和辅酶（主要成色物质）大分子物质甘氨酸和L-丝氨酸浓缩分步结晶得成品L-丝氨酸生产过程中产生的废水丝氨酸生产过程中产生的废水1.1.发酵产生的废水：发酵产生的废水：发酵细胞收集后产生的废水主要有无机盐和细胞碎片。2.2.酶转化后产生的废水酶转化后产生的废水：因工艺的需要使用少量的酸碱，部分四氢叶酸在转化过程中会被酶利用和分解。脱色使用的活性炭和细胞碎片、酶蛋白一起成为主要的固体废弃物。3 3辅酶四氢叶酸合成产生的废气和废水：辅酶四氢叶酸合成产生的废气和废水： 四氢叶酸合成过程有硫化氢气体产生，可用碱液吸收。废液主要含盐，但是废液的量很少。此此L-丝氨酸生产工艺相关专利情况调查丝氨酸生产工艺相关专利情况调查用于表达丝氨酸羟甲基转移酶的基因来源用于表达丝氨酸羟甲基转移酶的基因来源来源于公开发表的基因组信息。工艺所用丝氨酸羟甲基转移酶及其基因专利情况工艺所用丝氨酸羟甲基转移酶及其基因