实验：猪胰蛋白酶的分离纯化

1、实验：猪胰蛋白酶的分离纯化主要内容n实验内容实验内容n实验目的实验目的n实验原理实验原理n实验方法实验方法n实验结果实验结果n实验报告格式实验报告格式实验内容实验内容n一、猪胰蛋白酶的分离纯化一、猪胰蛋白酶的分离纯化 n二、蛋白质含量的测定二、蛋白质含量的测定n三、酶活力的测定三、酶活力的测定n四、纯化效果检测四、纯化效果检测 SDS-PAGE电泳检测电泳检测实验目的实验目的 n1、掌握盐析沉淀法、透析法及离子交换层析的原、掌握盐析沉淀法、透析法及离子交换层析的原理和操作过程；理和操作过程；n2、熟悉胰蛋白酶分离纯化的一般过程；、熟悉胰蛋白酶分离纯化的一般过程；n3、掌握胰蛋白酶活力测定方法及

2、、掌握胰蛋白酶活力测定方法及SDS-聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。胺凝胶电泳技术。实验原理实验原理n一、胰蛋白酶的基本特性一、胰蛋白酶的基本特性n二、本实验采用的分离纯化方法的原理二、本实验采用的分离纯化方法的原理n1. 沉淀法沉淀法n2. 透析法透析法n3. 离子交换层析技术离子交换层析技术n三、胰蛋白酶活性测定原理三、胰蛋白酶活性测定原理实验原理实验原理一、胰蛋白酶的基本特性一、胰蛋白酶的基本特性n胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激

3、活，从肽链从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的有活性的胰蛋白酶胰蛋白酶。n猪胰蛋白酶的分子量约为猪胰蛋白酶的分子量约为23.4 kDa，其等电点约为，其等电点约为pI=10.8，最适最适pH7.68.0， 胰蛋白酶在胰蛋白酶在pH=3左右较稳定，左右较稳定，Ca2+离子离子对胰蛋白酶有稳定作用，在低温条件下贮存数周内酶的活性对胰蛋白酶有稳定作用，在低温条件下贮存数周内酶的活性不发生明显的改变。不发生明显的改变。LysValAspAspAspAspGlyIl

4、eLysValAspAspAspAspValHisSerGlyIleValHisSerEnteropeptidase肠激酶肠激酶Trypsin胰蛋白酶胰蛋白酶Active siteThe process of trypsinogen activation胰蛋白酶原激活过程胰蛋白酶原激活过程实验原理实验原理二、本实验采用的分离纯化方法的原理二、本实验采用的分离纯化方法的原理n盐析沉淀法：用硫酸铵盐析法将目的蛋盐析沉淀法：用硫酸铵盐析法将目的蛋白从粗提液中沉淀出来，使其得到浓缩，白从粗提液中沉淀出来，使其得到浓缩，并除去部分杂质（核酸、杂蛋白等）。并除去部分杂质（核酸、杂蛋白等）。1. 沉淀法沉淀

5、法实验原理实验原理二、本实验采用的分离纯化方法的原理二、本实验采用的分离纯化方法的原理n由于膜两侧的溶质浓度不同，在浓度差由于膜两侧的溶质浓度不同，在浓度差的作用下，高分子溶液（如蛋白溶液）的作用下，高分子溶液（如蛋白溶液）中的小分子溶质（如无机盐）透向透析中的小分子溶质（如无机盐）透向透析液一侧，同时透析液中的缓冲液渗入蛋液一侧，同时透析液中的缓冲液渗入蛋白溶液一侧，经过透析液反复换液后，白溶液一侧，经过透析液反复换液后，即可达到脱盐和置换缓冲液的目的。即可达到脱盐和置换缓冲液的目的。1. 透析法透析法实验原理实验原理二、本实验采用的分离纯化方法的原理二、本实验采用的分离纯化方法的原理n同类

6、型的带电离子间可自由地相互交换和竞争结合。同类型的带电离子间可自由地相互交换和竞争结合。n蛋白质在其等电点以下（蛋白质在其等电点以下（pHpI），带负电荷，可被阴离子交换树），带负电荷，可被阴离子交换树脂所吸附。脂所吸附。n本实验中的猪胰蛋白酶等电点为本实验中的猪胰蛋白酶等电点为pI=10.8，在，在pH=5.0的缓冲液中猪胰蛋白酶带正电的缓冲液中猪胰蛋白酶带正电荷，可被阳离子交换树脂所吸附（本实验采用荷，可被阳离子交换树脂所吸附（本实验采用CM-纤维素离子交换树脂）；而带纤维素离子交换树脂）；而带负电荷的杂蛋白不被吸附而除去，带正电荷的杂蛋白也被吸附，但不同蛋白与树负电荷的杂蛋白不被吸附而除

7、去，带正电荷的杂蛋白也被吸附，但不同蛋白与树脂的吸附能力不同，通过增加缓冲液中的离子强度及提高脂的吸附能力不同，通过增加缓冲液中的离子强度及提高pH，可将蛋白从树脂上，可将蛋白从树脂上洗脱下来。洗脱下来。n在不同的离子强度下，可将不同的蛋白分别洗脱（结合力弱的蛋白最先洗脱，结在不同的离子强度下，可将不同的蛋白分别洗脱（结合力弱的蛋白最先洗脱，结合力强的蛋白最后洗脱）。合力强的蛋白最后洗脱）。n通过以上离子交换层析法，即可将目的蛋白和杂蛋白分开，从而通过以上离子交换层析法，即可将目的蛋白和杂蛋白分开，从而得到纯化。得到纯化。3. 离子交换层析法离子交换层析法实验原理实验原理三、胰蛋白酶活性测定原

8、理三、胰蛋白酶活性测定原理n胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如精氨酸、对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所组成的肽键具有专一性。赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所组成的肽键具有专一性。特别表现在对碱性氨基酸羧基一侧的选择性。特别表现在对碱性氨基酸羧基一侧的选择性。 n本实验以酪蛋白为底物的方法来测定胰蛋白酶活力，其主本实验以酪蛋白为底物的方法来测定胰蛋白酶活力，其主要用于测定胰蛋白酶粗制品的活力。要用于测定胰蛋白酶粗制品的活力。n胰蛋白酶催化水解底物酪蛋白生成不被三氯乙酸沉淀的小分子肽以胰蛋白酶催化水解底物酪蛋白生成不被三氯乙

9、酸沉淀的小分子肽以及氨基酸。在一定浓度范围内酶的水解滤液在波长及氨基酸。在一定浓度范围内酶的水解滤液在波长280nm处光吸收处光吸收的增值与胰蛋白酶的活力单位成正比的增值与胰蛋白酶的活力单位成正比。n活力单位的定义：在一定条件下每分钟酶水解底物活力单位的定义：在一定条件下每分钟酶水解底物酪蛋白形成的溶液在酪蛋白形成的溶液在280nm处吸处吸光度光度A280增加一个单位的酶量为一个蛋白酶活力单位（增加一个单位的酶量为一个蛋白酶活力单位（U）。）。实验方法实验方法 n一、猪胰蛋白酶的分离纯化一、猪胰蛋白酶的分离纯化 n二、蛋白质含量的测定二、蛋白质含量的测定n三、酶活力的测定三、酶活力的测定n四、

10、纯化效果测定四、纯化效果测定 SDS-PAGE电泳检测电泳检测实验方法实验方法一、一、猪胰蛋白酶的分离纯化猪胰蛋白酶的分离纯化 n（1）粗猪胰蛋白酶的提取粗猪胰蛋白酶的提取 n（2）透析）透析n（3）离子交换层析法纯化猪胰蛋白酶）离子交换层析法纯化猪胰蛋白酶 n实验具体操作参见实验具体操作参见实验指导实验指导实验方法实验方法一、一、猪胰蛋白酶的分离纯化猪胰蛋白酶的分离纯化n猪胰脏去脂肪和结缔组织，切碎，称重约猪胰脏去脂肪和结缔组织，切碎，称重约50 g50 g 加入加入5 5倍体积预冷的倍体积预冷的pH2.5pH2.5乙酸酸化水乙酸酸化水n组织捣碎组织捣碎n提取、过滤（四层纱布）、离心（提取、

11、过滤（四层纱布）、离心（44下，下，10000 rpm10000 rpm，离心，离心15 min 15 min ）取上清（记录取上清（记录体积，收集约体积，收集约1.5 mL1.5 mL，作为留样，作为留样1 1，测蛋白含量，及时，测蛋白含量，及时SDSSDS化）化）n加入固体无水氯化钙粉末加入固体无水氯化钙粉末n为猪胰蛋白酶原的激活提供为猪胰蛋白酶原的激活提供CaCa2+2+（含有（含有0.1 mol/L CaCl0.1 mol/L CaCl2 2 ）需计算需计算CaClCaCl2 2的用量。的用量。n加入极少量猪胰蛋白酶（约加入极少量猪胰蛋白酶（约2-5mg2-5mg）n 调调pHpH为为

12、 8.0 8.0 、于、于2525下活化下活化4646小时，（小时，（1 1小时取样一次，并用小时取样一次，并用0.001mol/L HCl0.001mol/L HCl稀释），测定酶活性增加的情况；稀释），测定酶活性增加的情况；n比活约比活约3500350040004000单位时，活化完成。单位时，活化完成。n用用2.5 mol/L H2SO42.5 mol/L H2SO4调调pHpH至至2.52.53.0(3.0(收集约收集约1.5 mL1.5 mL，作为留样，作为留样2 2，测蛋白含量，及时，测蛋白含量，及时SDSSDS化化 ) )n硫酸铵盐析沉淀（硫酸铵盐析沉淀（75%75%饱和度）饱和

13、度） 计算硫酸铵用量时需扣除形成硫酸钙的量。计算硫酸铵用量时需扣除形成硫酸钙的量。 （于（于44静置静置过夜）过夜）n离心（离心离心（离心10000 rpm10000 rpm，15 min15 min）取沉淀（为粗胰蛋白酶取沉淀（为粗胰蛋白酶 ）（1） 粗猪胰蛋白酶的提取粗猪胰蛋白酶的提取 实验方法实验方法一、一、猪胰蛋白酶的分离纯化猪胰蛋白酶的分离纯化n将粗胰蛋白酶溶于适量预冷的将粗胰蛋白酶溶于适量预冷的0.001 mol/L HCl溶液中（用溶液中（用2 mol/L HCl调蒸调蒸馏水馏水pH至至3即可！）。即可！）。n在在4下对下对0.001 mol/L HCl溶液透析溶液透析3小时左右

14、（小时左右（每小时换液每小时换液1次次 ！）n而后改用而后改用0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲液透析（柠檬酸钠缓冲液透析（至少换液至少换液3次，第一次次，第一次1小时后换液，第二次是小时后换液，第二次是2小时后换液，第三次是小时后换液，第三次是3小时后换液，然后过小时后换液，然后过夜透析夜透析 ！） （记录样品体积，收集约（记录样品体积，收集约1.5 mL，作为留样，作为留样3，测蛋白含量，及时，测蛋白含量，及时SDS化）化）（2）透析）透析恒流泵恒流泵部分收集器部分收集器离子交换柱离子交换柱离子交换流程简图离子交换流程简图实验方法实验方法一、猪胰蛋白酶的分离纯化一、猪胰蛋白酶

15、的分离纯化（3）离子交换层析法纯化猪胰蛋白酶）离子交换层析法纯化猪胰蛋白酶 实验方法实验方法一、一、猪胰蛋白酶的分离纯化猪胰蛋白酶的分离纯化n柱的平衡：用柱的平衡：用0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲液平衡柠檬酸钠缓冲液平衡CM-纤维素离纤维素离子交换柱子交换柱n样品吸附：用恒流泵样品吸附：用恒流泵直接上样于直接上样于CM-纤维素离子交换柱纤维素离子交换柱n洗涤：以洗涤：以0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲液充分洗净未吸附柠檬酸钠缓冲液充分洗净未吸附蛋白质蛋白质n洗脱洗脱1：用：用0.05 mol/L , pH5.0，柠檬酸钠缓冲液洗脱，并分部，柠檬酸钠缓冲液洗脱，

16、并分部收集样品，测定每个样品的蛋白含量，做层析曲线，将出现一收集样品，测定每个样品的蛋白含量，做层析曲线，将出现一个蛋白峰（收集样品为留样个蛋白峰（收集样品为留样4），此峰为猪胰凝乳蛋白酶。），此峰为猪胰凝乳蛋白酶。n洗脱洗脱2：待胰凝乳蛋白酶峰过后，改用：待胰凝乳蛋白酶峰过后，改用0.1 mol/L , pH6.0，柠檬酸钠，柠檬酸钠缓冲液洗脱，并分部收集样品，测定每个样品的蛋白含量，做层析曲缓冲液洗脱，并分部收集样品，测定每个样品的蛋白含量，做层析曲线，将出现一个蛋白峰（收集样品为留样线，将出现一个蛋白峰（收集样品为留样5），此峰为猪胰蛋白酶。），此峰为猪胰蛋白酶。n柱的再生柱的再生（4）

17、离子交换层析法纯化猪胰蛋白酶）离子交换层析法纯化猪胰蛋白酶 装柱装柱 平衡平衡 沿壁倒下沿壁倒下均匀均匀无气泡、裂纹无气泡、裂纹装柱装柱平衡平衡离子交换树脂离子交换树脂1 ml/min0.01 mol/L , pH5.0柠柠檬酸钠缓冲液檬酸钠缓冲液 3cm3cm0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲液柠檬酸钠缓冲液恒流泵恒流泵上样上样用用0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲液透析后的柠檬酸钠缓冲液透析后的粗酶液粗酶液注：需将未吸附样注：需将未吸附样品（流穿）进行品（流穿）进行SDS-PAGE检测！检测！恒流泵恒流泵洗涤洗涤0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠柠檬酸

18、钠缓冲液缓冲液恒流泵恒流泵洗脱洗脱1 10.05 mol/L , pH5.0，柠檬酸钠缓冲液柠檬酸钠缓冲液离子交换柱离子交换柱部分收集器部分收集器恒流泵恒流泵洗脱洗脱2 20.1 mol/L , pH6.0，柠檬酸，柠檬酸钠缓冲液钠缓冲液离子交换柱离子交换柱部分收集器部分收集器实验方法实验方法二、蛋白质含量的测定二、蛋白质含量的测定n方法：紫外吸收法方法：紫外吸收法n所测样品：所测样品：n猪胰蛋白酶纯化过程中的预留样品猪胰蛋白酶纯化过程中的预留样品1样品样品5，用来计算，用来计算比活和纯化倍数；比活和纯化倍数；n离子交换层析过程中的分部收集样品，用来作层析曲线离子交换层析过程中的分部收集样品，

19、用来作层析曲线（以样品管号为横坐标，以（以样品管号为横坐标，以A280A280为纵坐标作曲线）为纵坐标作曲线）实验方法实验方法三、酶活力的测定三、酶活力的测定n取取3支试管按支试管按13编号：编号： 1为样品管、为样品管、 2 为对照管、为对照管、 3为空白管为空白管n1为样品管为样品管n稀释酶液（根据蛋白含量测定结果，用稀释酶液（根据蛋白含量测定结果，用0.1mol/L Tris-HCl、pH 8.0缓冲液稀释至缓冲液稀释至1080g/mL ）后，取）后，取 1 ml；n精确加入精确加入1mL 37 预热的预热的10 mg/mL酪蛋白溶液；酪蛋白溶液；n混匀，立即置于混匀，立即置于37水浴中

20、，准确反应水浴中，准确反应10min；n加入加入3 mL 8三氯乙酸三氯乙酸 ，迅速摇匀，终止反应；，迅速摇匀，终止反应；n离心（离心（ 3000 r/min,5min）取上清；取上清；n测测A280 1. 测定方法测定方法n2 为对照管为对照管n精确加入精确加入37 1ml预热的预热的10 mg/mL酪蛋白溶液；酪蛋白溶液；n加入加入3 mL 8三氯乙酸三氯乙酸 ，迅速摇匀；，迅速摇匀；n加加1 mL稀释酶液（与样品管相同）；稀释酶液（与样品管相同）；n混匀，立即置于混匀，立即置于37水浴中，准确反应水浴中，准确反应10min；n离心（离心（ 3000 r/min,5min）取上清取上清n测

21、测A280 n3为空白管为空白管n分别加入分别加入 3 mL 8三氯乙酸和三氯乙酸和2 mL 0.1 mol/L Tris-HCl、pH 8.0 缓冲液，缓冲液， n离心（离心（ 3000 r/min,5min）取上清取上清n用该样品作为空白，用来测定样品管（用该样品作为空白，用来测定样品管（1 ）和对照）和对照管（管（ 2 ）的）的A280。实验方法实验方法三、酶活力的测定三、酶活力的测定n胰蛋白酶活力单位数胰蛋白酶活力单位数= A280/tn式中，式中， A280样品管样品管A280-对照管对照管A280n t反应时间（反应时间（min）n比活力比活力=酶活力单位酶活力单位/毫克蛋白质毫克

22、蛋白质=A280/CVtn式中，式中， A280样品管样品管A280-对照管对照管A280 C每个样品管中酶液的浓度（每个样品管中酶液的浓度（mg/mL） V每个样品管中酶液体积（每个样品管中酶液体积（mL) t反应时间（反应时间（min）2. 胰蛋白酶活力的计算胰蛋白酶活力的计算 实验方法实验方法三、酶活力的测定三、酶活力的测定n猪胰蛋白酶纯化过程中的预留样品猪胰蛋白酶纯化过程中的预留样品1样品样品5，用来计算，用来计算比活和纯化倍数；比活和纯化倍数；n离子交换层析过程中的分部收集样品中，蛋白峰离子交换层析过程中的分部收集样品中，蛋白峰附近的样品。附近的样品。3. 需测样品需测样品实验方法实

23、验方法四、纯化效果检测四、纯化效果检测n用用12 的的SDSPAGE检测，考马斯亮蓝检测，考马斯亮蓝R-250染色。染色。n粗酶液留样粗酶液留样1，n胰酶激活后样品留样胰酶激活后样品留样2，n透析后的样品透析后的样品3（上柱前样品）（上柱前样品）n未吸附样品（流穿）未吸附样品（流穿）n离子交换层析后洗脱离子交换层析后洗脱1（留样（留样4 ）n离子交换层析后洗脱离子交换层析后洗脱2中活力较高样品（留样中活力较高样品（留样5）实验结果n1离子交换层析后收集各管样品的蛋白含量及活离子交换层析后收集各管样品的蛋白含量及活性。性。n2. 以管数为横坐标、以以管数为横坐标、以A280及活性为纵坐标，制及活性为纵坐标，制作双坐标图的作双坐标图的离子交换层析曲线离子交换层析曲线。n3测定粗酶液、胰酶激活后样品、离子交换层析测定粗酶液、胰酶激活后样品、离子交换层析收集管中样品液的体积及酶活力，完成收集管中样品液的体积及酶活力，完成纯化表格纯化表格。n4S