原生质体的培养与融合

1、第十一章第十一章 原生质体的培养与融合原生质体的培养与融合原生质体的分离与纯化原生质体的分离与纯化原生质体培养原生质体培养原生质体融合原生质体融合本章主要内容本章主要内容 原生质体（原生质体（Protoplast）l含义：含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。具有生活力的裸露细胞。微微 丝丝叶绿体叶绿体线粒体线粒体质质 膜膜细胞核细胞核内质网内质网微微 管管细胞壁细胞壁高尔基体高尔基体液液 泡泡第一节第一节 原生质体分离及纯化原生质体分离及纯化l一、原生质体分离原生质体分离双子叶外植体双子叶外植体胚性细胞胚性细胞l多数植物分离原生质体的经典材料多数植物分离

2、原生质体的经典材料- -叶肉细胞。叶肉细胞。（一）材料来源（一）材料来源l禾本科植物：禾本科植物： 愈伤组织或悬浮细胞。愈伤组织或悬浮细胞。（二）（二） 分离方法分离方法机械分离法机械分离法酶法分离法酶法分离法1、机械分离法（、机械分离法（Machanical isolation）优点：优点：（1）能排除酶的有害影响能排除酶的有害影响；缺点：缺点：（1）原生质体的产量低；原生质体的产量低；（2）方法繁琐费力；）方法繁琐费力；（3）局限性大）局限性大（1 1）酶的种类）酶的种类l纤维素酶类（纤维素酶类（CellulaseCellulase） l果胶酶类（果胶酶类（PectolyasePectol

3、yase）l半纤维素酶类（半纤维素酶类（HemicellulaseHemicellulase）l崩溃酶崩溃酶l蜗牛酶蜗牛酶2、酶法分离（酶法分离（Enzymatic isolation）（2 2）酶液的配制）酶液的配制渗透压稳定剂渗透压稳定剂及及pH酶的配比及浓酶的配比及浓度度果胶酶：浓度不宜超过果胶酶：浓度不宜超过2%, 纤维素酶纤维素酶(1-2%)渗透压稳定剂渗透压稳定剂:（500600mmol/L甘露醇甘露醇)（3 3）分离原生质体）分离原生质体两步分离法两步分离法一步分离法一步分离法方法有二：方法有二：叶肉原生质体分离提纯叶肉原生质体分离提纯图示原生质体分离过程（以叶片为例）图示原生质

4、体分离过程（以叶片为例）过滤、离心过滤、离心加果胶酶加果胶酶和纤维素酶和纤维素酶叶片叶片愈伤组织愈伤组织二、二、 原生质体纯化与活力测定原生质体纯化与活力测定（一）原生质体纯化（一）原生质体纯化方法三种方法三种离心沉淀法离心沉淀法漂浮法漂浮法界面法界面法1、 离心沉淀法l原理原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。原生质体沉于底部。l步骤步骤：l第一步原生质体溶液用第一步原生质体溶液用400400目网筛过滤。目网筛过滤。l第二步离心（第二步离心（500-1000r/min500-1000r/min，离心，离心5-6min5-6min）。）。

5、l第三步吸去上清液，洗涤液重新悬浮，再离心第三步吸去上清液，洗涤液重新悬浮，再离心沉淀。如此沉淀。如此2-32-3次。次。l第四步用原生质体培养液洗第四步用原生质体培养液洗1 1次，收集原生质次，收集原生质体。体。2、漂浮法原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。浮在液体的表面。l步骤步骤：l第一步：第一步：400400目网筛过滤。目网筛过滤。l第二步：滤液和高渗溶液混合，离心。第二步：滤液和高渗溶液混合，离心。l第三步：小心吸取上层原生质体，洗涤液重复洗第三步：小心吸取上层原生质体，洗涤液重复洗2-32-3次。次。l第四步：收集

6、溶液表面原生质体，用培养液洗第四步：收集溶液表面原生质体，用培养液洗1 1次。次。 3 、 界面法界面法25%蔗糖溶液蔗糖溶液13%甘露醇溶液甘露醇溶液原理：原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。另一种溶液小于原生质体的密度。（二）（二） 原生质体活力测定原生质体活力测定1、形态识别：、形态识别：形态上完整，呈圆形，含有饱满的形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。2、染色识别、染色识别l1 1）0.1%0.

7、1%酚番红染色：有活力的不被染色，死亡酚番红染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。的被染上色。l2 2）0.025%Evans0.025%Evans蓝染色：蓝染色：有活力但受损伤的细胞有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取和死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取 l2 2）双醋酸盐荧光素）双醋酸盐荧光素(FDA)(FDA)染色法：在荧光显微镜染色法：在荧光显微镜下有荧光的即为有活性的原生质体。下有荧光的即为有活性的原生质体。第二节第二节 原生质体培养原生质体培养一、培养基一、培养基pH渗透压渗透压钙源钙源生长物质生长物质氮源氮源碳源碳源培养基培养基二、培养方法二、培养方法培

8、养方法培养方法液体浅层培养液体浅层培养平板培养法平板培养法双层培养法双层培养法饲养层培养法饲养层培养法肉眼可见细胞团肉眼可见细胞团愈伤组织愈伤组织器官发生途径器官发生途径胚胎发生途径胚胎发生途径植株植株植株再生途径植株再生途径定义：定义：原生质体融合原生质体融合也叫做也叫做体细胞杂交体细胞杂交，使分离出来的不同亲本的原生质体，在人使分离出来的不同亲本的原生质体，在人工控制条件下，相互融合成一体，形成杂工控制条件下，相互融合成一体，形成杂种细胞，并进一步发育成杂种植株的技术。种细胞，并进一步发育成杂种植株的技术。第三节第三节 原生质体融合原生质体融合原生质体融合原生质体融合一、原生质体融合意义一

9、、原生质体融合意义克服杂交不亲合克服杂交不亲合克服生殖器官败育克服生殖器官败育克服多胚现象克服多胚现象番茄番茄+ +马铃薯马铃薯二、融合方法二、融合方法 无机盐诱导融合无机盐诱导融合 高高pH-高高Ca离子离子 聚乙二醇聚乙二醇(PEG)法法 PEG结合高钙结合高钙-高高pH诱导法诱导法 电融合技术电融合技术(一一)无机盐诱导融合无机盐诱导融合: NaNO3法法l1972年：年： Carlson诱导原生质体融合获诱导原生质体融合获得首例杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体得首例杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞杂种。细胞杂种。NaNO3的作用：的作用：中和质膜的负电荷，使原中和质膜的负电荷，使原生质体不

10、再相互排斥，而紧密结合在一起生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起不足：诱导频率不高。不足：诱导频率不高。 19731973年：年：KellerKeller用用pH10.5pH10.5的的50 mM CaCl50 mM CaCl2 2溶溶液在液在3737时，诱发烟草叶肉原时，诱发烟草叶肉原生质体融合。生质体融合。优点：杂种产量高。优点：杂种产量高。不足：高不足：高pHpH值对细胞有毒害作用。值对细胞有毒害作用。（二）高（二）高pH-高高Ca离子法离子法PEG法法特点：特点：融合频率高融合频率高可重复性强可重复性强诱发融合无特异性诱发融合无特异性毒性较低毒性较低植物植物+ +植物植物植物植物+ +

11、动物动物动物动物+ +酵母酵母Polyethylene Glycol（聚乙二醇）（聚乙二醇）（三）PEG法PEG法法原理原理PEG是一种带负电性的高分子化合物，在原是一种带负电性的高分子化合物，在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体凝聚。在洗脱过程中，凝聚。在洗脱过程中，PEG将被洗掉，导致质膜表将被洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的面电荷重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生重排导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相连而导致融合。质体的正性电荷部位

12、相连而导致融合。PEGPEG法法示意图示意图-+-桥梁桥梁+-PEG被洗掉被洗掉+-+-电荷重排电荷重排+-+-+-+-膜接触膜接触最为常用。最为常用。具体做法具体做法：在无菌条件下混合双亲原生质体：在无菌条件下混合双亲原生质体- -滴加滴加PEGPEG溶液，摇匀，静置溶液，摇匀，静置-滴加高钙滴加高钙- -高高pHpH溶液，摇匀，静置溶液，摇匀，静置-滴加原生质体培养液洗涤滴加原生质体培养液洗涤数次数次-离心获得原生质体细胞团离心获得原生质体细胞团-筛选筛选-再再生杂合细胞生杂合细胞（四）（四）PEG结合高钙结合高钙-高高pH诱导法诱导法(五五)电融合技术电融合技术Senda 首先用此方法实

13、现原生质体融合首先用此方法实现原生质体融合细胞融合仪细胞融合仪电融合法原理电融合法原理 交流电场使原生质体表面电荷偶极交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠。化，沿着电极排列，形成串珠。+-负极负极正极正极+-+-+-+-+-+-+-+-施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。+-+-+-+-+-+-+-+-原生质体的融合过程：原生质体的融合过程：三、体细胞杂种细胞筛选与鉴定三、体细胞杂种细胞筛选与鉴定1 1互补选择法互补选择法2、机械分离杂种细胞法、机械分离杂种细

14、胞法3. 双荧光标记选择法双荧光标记选择法异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（FITC）：绿色）：绿色异硫氰酸罗丹明（异硫氰酸罗丹明（RITC）：红色）：红色3. 3. 双荧光标记选择法双荧光标记选择法四、体细胞杂种植株的鉴定四、体细胞杂种植株的鉴定q 形态学鉴定形态学鉴定q 细胞学观察细胞学观察q DNA多态性分析多态性分析q 同工酶分析同工酶分析4-1、形态学鉴定、形态学鉴定4-2、细胞学观察、细胞学观察染色体形态和数目的比较染色体形态和数目的比较18条染色体条染色体36条染色体条染色体4-3 DNA多态性分析多态性分析RAPD带型带型（随机扩增的多态性（随机扩增的多态性DNA） 4-4 同功

15、酶鉴定同功酶鉴定l根据亲本和杂种同功酶根据亲本和杂种同功酶谱的差异来鉴别杂种。谱的差异来鉴别杂种。有的呈双亲谱带的总和、有的呈双亲谱带的总和、有的出现新谱带或丢失有的出现新谱带或丢失部分亲本谱带。常用的部分亲本谱带。常用的鉴定酶为：乙醇脱氢酶、鉴定酶为：乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、过氧化物乳酸脱氢酶、过氧化物酶、酯酶等。酶、酯酶等。l(1) 原生质体培养的意义：原生质体培养的意义：l(2) 原生质体分离方法：机械分离法、酶法分离。原生质体分离方法：机械分离法、酶法分离。 l(3) 原生质体的纯化方法：离心沉淀法；漂浮法；原生质体的纯化方法：离心沉淀法；漂浮法；界面法。界面法。l(4)原生质体活力的测定：形态识别；染色识别。原生质体活力的测定：形态识别；染色识别。l(5)原生质体培养方法：液体浅层培养；平板法原生质体培养方法：液体浅层培养；平板法培养；悬滴法培养；双层培养法；饲喂层培养培养；悬滴法培养；双层培养法；饲喂层培