DNA提取及常见问题分析和对策

1、4口DNA提取和常见问题分析及对策主讲人：关镒整理分享j.DN蔺单介绍DN编遗传信息的载体,1是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象.为了进行测序、杂交和基因的表达,获得高分子量和高纯度的DNAb非常重要的前提.,DNA提取原那么*保证 DN 皓构的完整性纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染DNA提取的几种方法:、非染色体DNA勺提取ILM.jfLj.质粒DNA勺提取？碱裂解法前尹vtoY?煮沸法线粒体、叶绿体DNA勺提取差速离心结合 SDSD 隈解法CTA 就原理(植物 DN 假取经典方法)hexa

2、decyltrimethylammoniumbromidehexadecyltrimethylammoniumbromide, ,:甲基澳化镂),是一林阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合物.该复合物在高盐溶液中(0.7mol/LNaCl0.7mol/LNaCl) )是可溶的,通过有机溶剂抽提、 去除蛋白、多糖、酚类等杂质后参加乙醇或异丙醇沅淀即可使核酸别离出来.注：CTABCTAB液在低于 15c15c 时会形成沉淀析出,因此在将其参加冰冷的植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于 1515CTAB(CTAB( 烷基三十六液氮研磨抽提异丙醇沉淀枯燥溶解DNDN 给液CTAB1 流程

3、图裂解液植物材料离心洗涤细胞裂解上层溶液kCTABP各个组分的作用EDTEDT 摩合 MdMd+离子或 M M 甲离子,抑制 DNaseDNase 舌性;j*1kNaClNaCl 提供一个高盐环境,使 DNDN 先分溶解,存在于液相中;CTAIBCTAIB 解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于别离；B B疏基乙醇是抗氧化剂,有效地预防酚氧化成酶,预防褐变,使酚容易去除.CTA提取缓冲液的改良配方CTACTA 眼取缓冲液的经典配方ijMTris-HClTris-HClpH8.0pH8.0提供一个缓冲环境,预防核酸被破坏;PVP聚乙烯口比咯烷酮是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚

4、,减少 DNDN 即酚的污染； 同时它也能和多糖结合,有效去除多糖.除蛋白质:J氯仿/异戊醇抽提氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的别离；异戊醇那么有助于消除抽提过程中出现的气泡.使用变性剂变性 11SDS 异硫甄酸腹等高盐洗涤蛋白酶处理除多糖:高盐法：用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中参加 1/21/2 体积的 5MNaCl,5MNaCl,高盐可溶解多糖.用多糖水解酶将多糖降解.在提取缓冲液中加一定量的氯苯1/21/2 体积,氯苯可以与多糖的羟基作用,从而去除多糖.除酚类物质:4在抽提液中参加预防酚类氧化的试剂:基乙醇.抗坏血酸.半胱氨酸.参加易与酚类结合的试剂：如 PVPPVP醇,它们与酚类

5、有较强的亲和力,B B-筑二硫PEGPEG 聚乙 可预防酚与 DNADNA 勺结合除盐离子:HK70%70%的乙醇洗涤-USB,TE中成分的作用立TETE 中的 EDTEDT 辘螯和 MjMj+或 MHMH+离子,抑制 DNaseDNase.0.0, ,可预防 DNAeDNAe 生酸解wntlB,Yl|-TvlUz2pHpH 直为称取样品,液氮研磨,参加预热的65CCTAB 及 B-琉基乙醇保温 1h,期间不停的摇均吸取上清液,移至新的离心管产,参加等体积氯仿：异戊醇24:1,轻缓颠倒混匀,10000rpm,10min取上清液,移至新的离也中,加等体积氯仿：异戊醇,颠倒混匀,10000rpm,

6、10min取上清液,参加 0.6-0.7V 的异丙醇预冷,后 4c/-20C 保温沉淀一10000rpm,10min 离心取沆淀,70 双酹清洗两次,吹干用 TE 容解 DNA 然后低温保存材料准备：最好使用新鲜材料,低温保存的样品材料不要反复冻融.液氮研磨：研磨样品时要有液氮的保护,在整个过程中都不要让液氮挥发干净.预防材料回温和反复冻融带来的降解.此外尽&量将样品研磨的很细,这样可以提升 DNA细胞裂解： 材料应适量,过多会影响裂解,导致 DNDN 屋少,纯度低.高温温浴时,定时轻柔振荡.DNDN 航淀：用乙醇或异丙醇都可以.异丙醇沉淀的效率要高于无水乙醇,试验中只需要 0.60.

7、6 倍体积的异丙醇沉淀；而需要 2 2 倍体1VJcfjiV积的无水乙醇.但是异丙醇沉淀容易将盐成分一起沉淀,且在 DNDN 航淀中异丙醇难以挥发除去.DNDN 所燥：晾干 DNADNA 让乙醇充分挥发.DNDN 给解：假设长期储存建议使用 TEgTEg 冲液溶解.曷质量的基因组 DNDN型单一无拖DNDN 维度及纯度的检测 A260=1A260=1双链 DNA,A260/280DNA,A260/280 约为 1 1M尾现象约 5050gg/mLg/mL. .DNA提取常见问题问题一：DNADNA 品不纯,抑制后续酶解和 PCPC 反响原因1.DNAPDNAP 含有蛋白、多糖、多酚类杂质2.D

8、NDN 的溶解前,有酒精残留,酒精抑制后续酶解反响3.DNAPDNAP 残留有金属离子4.有RNA勺存留?重新纯化 DNADNA 过吸附柱去除蛋白、多糖、多酚等杂质?重新沉淀 DNADNA 让酒精充分择技?增加 70%70%乙醇洗涤的次数2-32-3 次?力口入 RNasRNas 掷解 RNARNADNA提取常见问题1.尽量取新鲜材料,低温保存材料避免反复冻融2 .液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻前参加裂解缓冲液3 .在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNAtDNAt 可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔4 .所有试剂用无菌水配制,耗材经高温灭菌5 .将 D DN N 粉装保存于缓冲液中,预防反复冻融原XZXZ1目料不新鲜或反复冻融2.未很好抑制内源核酸酶的活性3.提取过程操作过于剧烈,D DN N僦机械打