第5章-胞外产电菌

1、LOGO第五章第五章 胞外产电菌胞外产电菌 李永峰李永峰 教授教授第五章第五章 胞外产电菌胞外产电菌5.1 简介简介15.2 电子转移的机制电子转移的机制25.3 细菌的形态结构与生理特点细菌的形态结构与生理特点35.4 群落分析群落分析45.5 将将MFC作为工具研究胞外产电菌作为工具研究胞外产电菌55.6 微生物驯化与鉴定微生物驯化与鉴定65.7微生物电解池产氢与传统产氢方法的比较微生物电解池产氢与传统产氢方法的比较75.1 简介简介 对对MFC而言，最令我们感兴趣的而言，最令我们感兴趣的是一些细菌能向细胞外传递电子，我们是一些细菌能向细胞外传递电子，我们把这些细菌叫做向细胞外直接转移电子

2、把这些细菌叫做向细胞外直接转移电子的产电菌（的产电菌（exoelectrogens），以下简称），以下简称“胞外产电菌胞外产电菌”。“exo-”表示胞外的，表示胞外的，且具有能将电子直接转化给化合物或间且具有能将电子直接转化给化合物或间接电子受体的能力。接电子受体的能力。5.2 电子转移的机制电子转移的机制5.2.1 纳米导线纳米导线细胞细胞-表面的电子传递表面的电子传递5.2.3 中介体中介体5.2.1纳米导线纳米导线 Gorgy及其同事发现并报道了及其同事发现并报道了Geobacter和和Shewanella菌属的导电附菌属的导电附属物，他们将其称为细菌的属物，他们将其称为细菌的“纳米导纳

3、米导线线”。使用传导隧道显微镜（。使用传导隧道显微镜（STM），），将样品放在一个高度规则的热解石墨表将样品放在一个高度规则的热解石墨表面（一个非常平的导电表面），在恒定面（一个非常平的导电表面），在恒定电流成像的条件下，使用一个导电的电流成像的条件下，使用一个导电的（Pt-Ir）尖端横跨样品进行光栅扫描，）尖端横跨样品进行光栅扫描，从而检测附属物的电导率。最终获得的从而检测附属物的电导率。最终获得的电压电压-电流曲线显示出扫描的部分与石电流曲线显示出扫描的部分与石墨表面之间具有导电性。墨表面之间具有导电性。5.2.2 细胞细胞-表面的电子传递表面的电子传递 纳米导线的存在并不意味着电子只纳米

4、导线的存在并不意味着电子只能通过纳米线转移，细菌也可以在没有能通过纳米线转移，细菌也可以在没有纳米导线生成的时候实现电子从细胞表纳米导线生成的时候实现电子从细胞表面到铁或阳极的转移。面到铁或阳极的转移。5.2.3 中介体中介体 化学中介体或电子中介体（化学中介体或电子中介体（shutle）经常被加入到经常被加入到MFC中，从而使细菌甚中，从而使细菌甚至酵母能传递电子。至酵母能传递电子。Rabaey和他的合和他的合作者发现，在作者发现，在MFC的培养基中电子中的培养基中电子中介体并不是必需的。这些自身产生的相介体并不是必需的。这些自身产生的相关化合物，可以将电子转移到电极上，关化合物，可以将电子

5、转移到电极上，从而在从而在MFC中产生电能。中产生电能。5.3 细菌的形态结构与生理特点细菌的形态结构与生理特点5.3.1 产电微生物的定义产电微生物的定义15.3.2产电微生物的类别产电微生物的类别25.3.3 MFC产电微生物的研究进展产电微生物的研究进展35.3.4微生物群落分析微生物群落分析45.3.5 MFC 产电微生物的电子传递机制产电微生物的电子传递机制55.3.6电池的电化学性能表征电池的电化学性能表征65.3.7阳极微生物的形态及电化学活性表征阳极微生物的形态及电化学活性表征75.3.1 产电微生物的定义产电微生物的定义产电微生物特指把有机物氧化过程中产生的电子通过电子传递链

6、产电微生物特指把有机物氧化过程中产生的电子通过电子传递链传递到电极上产生电流，同时自身在电子传递过程中获得能量支持传递到电极上产生电流，同时自身在电子传递过程中获得能量支持菌类的生长，又称为电活性微生物或电极呼吸微生物。菌类的生长，又称为电活性微生物或电极呼吸微生物。表表 5 5.1 MFC 在产电过程中不同类型微生物的比较在产电过程中不同类型微生物的比较微生物种类微生物种类库伦效率（库伦效率（%）是否独立存活是否独立存活是否需要外源性介是否需要外源性介体体是否用于开放环境是否用于开放环境发酵微生物发酵微生物10否否否否是是包含外源性介体的包含外源性介体的微生物微生物10否否是是否否Shewa

7、nella 属属90是是否否是是5.3.2 产电微生物的类别产电微生物的类别1希 瓦 氏 菌2铁还原红育菌3硫还原地杆菌4沼泽红假单胞菌5人苍白杆菌6铜绿假单胞菌7丁酸梭菌8其他产电菌种5.3.3 MFC产电微生物的研究进展产电微生物的研究进展234细细菌菌类类的的产产电电微微生生物物真真菌菌类类的的产产电电微微生生物物光光合合生生物物类类的的产产电电微微生生物物微微生生物物群群落落作作产产电电微微生生物物5.3.4 微生物群落分析微生物群落分析(1) 165rRNA基因文库的构建和分析方法基因文库的构建和分析方法 采用小量细菌采用小量细菌DNADNA抽提试剂盒从电极提取基因组抽提试剂盒从电极

8、提取基因组DNADNA。(2) 变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳(DGGE) 采用采用BSF338/BSR534引物进行引物进行DGGE-PCR图谱的电泳。图谱的电泳。PCR扩增产物5.3.5 MFC 产电微生物的电子传递机制产电微生物的电子传递机制据研究发现产电微生物向阳极传递电子分据研究发现产电微生物向阳极传递电子分2 步走，第步走，第1 步是电子在细胞内产生并向细胞表面传递；第步是电子在细胞内产生并向细胞表面传递；第2 步是电步是电子到达细胞表面后向子到达细胞表面后向MFC 阳极传递。阳极传递。（1） 由细胞内向细胞表面的电子传递由细胞内向细胞表面的电子传递一些产电微生物可依靠其膜上的脱

9、氢酶直接氧化小分子的有一些产电微生物可依靠其膜上的脱氢酶直接氧化小分子的有机酸，释放电子给细胞膜上的电子载体，另一些产电微生机酸，释放电子给细胞膜上的电子载体，另一些产电微生物可氧化糖类等稍微复杂的有机物生成物可氧化糖类等稍微复杂的有机物生成NADH，然后在，然后在NADH脱氢酶的作用下，电子从脱氢酶的作用下，电子从NADH 转移至电子传递转移至电子传递链，到达细胞表面的氧化还原蛋白。链，到达细胞表面的氧化还原蛋白。（2） 由细胞表面向由细胞表面向MFC 阳极的电子传递阳极的电子传递产电微生物在细胞内氧化有机物产生的电子被传递至细胞表产电微生物在细胞内氧化有机物产生的电子被传递至细胞表面后，被

10、证实将会通过面后，被证实将会通过2 种传递机制将电子传递到种传递机制将电子传递到MFC阳极上，阳极上，1 种是电子穿梭机制；种是电子穿梭机制；1 种是生物膜机制。种是生物膜机制。PCR扩增产物5.3.6电池的电化学性能表征电池的电化学性能表征在每个在每个MFC上串联一个上串联一个1 k电阻，电阻电电阻，电阻电压采用万用表测量，电路电流根据电阻电压计算压采用万用表测量，电路电流根据电阻电压计算得到，并换算成基于得到，并换算成基于MFC阳极面积阳极面积(45 cm2)的的电流密度。电池输出功率密度由输入电压及电流电流密度。电池输出功率密度由输入电压及电流密度相乘得到。监测阳极电势时，参比电极是密度

11、相乘得到。监测阳极电势时，参比电极是AgCl/Ag电极，对电极采用电极，对电极采用R电极。极化曲线实电极。极化曲线实验在每次刺激后验在每次刺激后2h进行，实验过程中分别连接进行，实验过程中分别连接10至至10000的一系列负载电阻，每个电阻的一系列负载电阻，每个电阻下稳定下稳定lh后测量电流及电阻电压。在测量开路电后测量电流及电阻电压。在测量开路电压之前，电路保持开路压之前，电路保持开路12h以达到稳态。以达到稳态。5.3.7 阳极微生物的形态及电化学活性表征阳极微生物的形态及电化学活性表征1表征阳极生物膜的循环伏安曲线在 CHI 660电化学工作站上得到。在循环伏安测量过程中分别采用双电极和

12、三电极体系。2电化学石英晶体微天平(EQCM)系统用来模拟微生物在电场中的电泳。3MFC阳极生物膜上的微生物形态采用日本 SHIMAQZU SSX-550扫描电镜(SEM)表征。5.4 群落分析群落分析5.4.1阴极室利用氧气的阴极室利用氧气的MFC15.4.2除氧气外的其他电子受体除氧气外的其他电子受体MFC25.4.3沉积物沉积物MFC35.4.4高温高温MFC45.4.1阴极室利用氧气的阴极室利用氧气的MFC以氧气为阴极电子受体的不同以氧气为阴极电子受体的不同MFC中的微生物群落分析中的微生物群落分析接 种 体底 物群 落江底沉积物（Phung等2004）葡萄糖+谷氨酸Alpha 占65

13、%（主要是Actinobacteria），Beta 占21%，Gammaproteobacteria占3%，Bacteroidetes占8%，其他占3%江底沉积物（Phung等2004）江水Alpha 占11%，Beta 占46%（与Leptothrix spp.相关），Gamma 占13%，Deltaprotebacteria占13%，Bacteroidetes占9%，其他占8%海底沉积物（Logan等2005）半胱氨酸Gammaproteobacteria（40%Shewanella affinis KMM），然后是Vibrio spp. 和Pseudoalteromonas spp.废水

14、（Lee等2003）乙酸Alpha占24%，Beta占7%，Gamma占21%，Deltaproteobacteria占21%，其他占27%废水（Kim等2004；Methe等2003）淀粉未鉴定的细菌占36%，Beta占25%，Alphaproteobacteria占20%，Cytophaga、Flexibacter、Bacterioides共占19%5.4.1阴极室利用氧气的阴极室利用氧气的MFCv 我们需要逐一比较我们需要逐一比较MFC的构型（如沉的构型（如沉积物、非沉积物、氧气、铁氰化钾和恒电位积物、非沉积物、氧气、铁氰化钾和恒电位MFC），底物和接种物（沉积物、江水和），底物和接种物

15、（沉积物、江水和废水细菌），从而更好地理解控制了废水细菌），从而更好地理解控制了MFC系统中生物群落的进化的因素。系统中生物群落的进化的因素。5.4.2除氧气外的其他电子受体除氧气外的其他电子受体MFCv 在以葡萄糖为底物、用铁氰化钾作阴极在以葡萄糖为底物、用铁氰化钾作阴极的的MFC中，中，Rabaey等应用变性梯度凝胶等应用变性梯度凝胶电泳（电泳（DGGE）技术，鉴定了生物膜中大量）技术，鉴定了生物膜中大量细菌的菌属。鉴定的序列分属于细菌的菌属。鉴定的序列分属于Firmicutes、Gamma 和和Alphaproteobacteria。5.4.3 沉积物沉积物MFCv 虽然沉积物虽然沉积物

16、MFC（SMFC）的阴极存在）的阴极存在氧气，但此系统与其他氧气，但此系统与其他MFC的根本区别在的根本区别在于样机上的细菌是与氧气完全隔绝的。于样机上的细菌是与氧气完全隔绝的。5.4.4 高温高温MFCv 少数研究者考察了正常实验室温度范围少数研究者考察了正常实验室温度范围之外的之外的MFC产电情况（温度达到产电情况（温度达到36）。）。Choi等在一个等在一个MFC系统中检测出了两株嗜系统中检测出了两株嗜热菌株（热菌株（Bacillus licheniformis和和B.thermoglucosidasius）。但是，其）。但是，其能量产生需要用到中介体，所以在这个实验能量产生需要用到中介

17、体，所以在这个实验中使用的菌株不属于胞外产电菌。高温下的中使用的菌株不属于胞外产电菌。高温下的一个问题是氧气的溶解度会随着温度的升高一个问题是氧气的溶解度会随着温度的升高而降低。而降低。5.5 将将MFC作为工具研究胞外产电菌作为工具研究胞外产电菌v 虽然研究虽然研究MFC的主要目的是产电，但的主要目的是产电，但同时同时MFC也为科学家提供了一个研究胞外也为科学家提供了一个研究胞外产电菌生态系统的有趣的新平台。当细菌降产电菌生态系统的有趣的新平台。当细菌降解不溶性金属时，其表面特征随时间而变化，解不溶性金属时，其表面特征随时间而变化，同时，因为金属离子的氧化同时，因为金属离子的氧化/还原相对浓

18、度还原相对浓度比例随时间的变化而变化导致了溶液化学性比例随时间的变化而变化导致了溶液化学性质变得更加复杂。然而在质变得更加复杂。然而在MFC中电极是不中电极是不会被腐蚀的，允许生物膜在其上生长并成熟。会被腐蚀的，允许生物膜在其上生长并成熟。5.6 微生物驯化与鉴定微生物驯化与鉴定5.6.15.6.25.6.35.6.4培养液培养液COD负负荷及外电荷及外电路电流对路电流对驯化的影驯化的影响响电极材料电极材料对电池性对电池性能的影响能的影响外电路不外电路不同负载对同负载对电池性能电池性能的影响的影响微生物分微生物分离纯化及离纯化及鉴定鉴定混合微生混合微生物菌群的物菌群的驯化及群驯化及群落分析落分

19、析5.6.55.6.1培养液培养液COD负荷及外电路电流对驯化的影响负荷及外电路电流对驯化的影响 活性污泥在新的培养体系下很难承受过大COD负荷的冲击，从而导致其微生物细菌代谢发生异常，抑制细菌代谢的正常进行，使产电菌部分失活。 不同COD负荷对电池性能的影响5.6.1培养液培养液COD负荷及外电路电流对驯化的影响负荷及外电路电流对驯化的影响 在初始阶段分别采用恒电流放电和恒电阻放电进行活性污泥的驯化，分别得到可两组电池性能指标 外电路电流对电池性能的影响5.6.2电极材料对电池性能的影响电极材料对电池性能的影响 以20% PTFE石墨膜为阳极材料所组装的电池在开路条件下阳极电势最负，且稳定时

20、间最长恒阻放电时其阳极电势也为最负，并且此时外电路电流最大，阳极极化较小，所以其阳极性能最好。 电极材料对电池性能的影响5.6.3外电路不同负载对电池性能的影响外电路不同负载对电池性能的影响 驯化到出现明显放电现象过程中，负载不同电阻的阳极电势变化。 驯化阶段不同负载的阳极电势不同负载下电池的能量密度随电流变化的关系图5.6.4微生物分离纯化及鉴定微生物分离纯化及鉴定 厌氧操作箱示意图液体厌氧培养用到的主要工具5.6.4微生物分离纯化及鉴定微生物分离纯化及鉴定 固体厌氧培养装置 单菌落形态特征5.6.5 混合微生物菌群的驯化及群落分析混合微生物菌群的驯化及群落分析v近年来的研究结果表明，直接用来自天近年来的研究结果表明，直接用来自天然厌氧环境的混合菌接种然厌氧环境的混合菌接种MFC，可以使电，可以使电流输出成倍增加，且在