专题5课题3血红蛋白提取分离1

1、2003年年4月月14日宣布人类基因组序列图完成日宣布人类基因组序列图完成这标志着进入了后基因组时代。这标志着进入了后基因组时代。人类基因组：指人类基因组：指DNA分子所携带的全部分子所携带的全部遗传信息。遗传信息。蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究总和。主要是对蛋白质功能的研究根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异，如的差异，如分分子的形状和大小、所带电荷的性质和多子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力亲和力等等，可以用来分离不同种类的等等，可以用来分

2、离不同种类的蛋白质。蛋白质。 一、基础知识一、基础知识 大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物（如（如葡聚糖葡聚糖或或琼脂糖琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。穿的通道。 根据被分离物质的蛋白质根据被分离物质的蛋白质相对分子质量相对分子质量的大小，利用具有的大小，利用具有网状结构网状结构的凝胶，来进行的凝胶，来进行分离。分离。相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢的通道，路程较长，移动速度较慢; ;相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶

3、内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。进行体外实验时，如何保证蛋白质不进行体外实验时，如何保证蛋白质不会发生变性呢？会发生变性呢？ 能够抵制能够抵制外界的酸和碱外界的酸和碱对溶液对溶液PHPH值值的影响，的影响，维持维持PHPH基本不变。基本不变。 通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓冲剂溶解于水溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的中配制而成。调节缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不不同同PHPH范围内范围内使用的缓冲液。使用的缓

4、冲液。磷酸缓冲液磷酸缓冲液, ,成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠 如何证明凝胶色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？如何证明凝胶色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 许多重要的生物大分子，如多肽、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的核酸等都具有可解离的基团，在一定的PHPH下，下，这些基团会带上正电或负电。这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带

5、电性质电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离中各种分子的分离。琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。 在测定蛋白质分子量时常用在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠（SDSSDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂是由单体丙烯酰胺和交联剂N,NN,N- -亚甲基双丙烯亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成

6、的具酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。有三维网状结构的凝胶。N,N-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。 。由几条肽链组成。由几条肽链组成的蛋白质复合体在的蛋白质复合体在SDSSDS的作用下会的作用下会，因此测定的结果只是因此测定的结果只是。SDSSDS能与各能与各种蛋白质形成种蛋白质形成，SDSSDS所带负电荷所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子的量大大超过了蛋白质分子。因而掩。因而掩盖了盖了，使电泳迁移率完，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。全取决于分子的大小。用用SDS SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的方法分子量的方法样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定蛋白质提取和分离步骤蛋白质提取和分离步骤（一）血红蛋白（一）血红蛋