单个实验室化学检测方法的确认

1、单个实验室化学检测方法的确认单个实验室化学检测方法的确认National Association of Testing Authorities(NATA)概要概要 基本情况基本情况 单个实验室方法确认的接受单个实验室方法确认的接受 什么是确认方法？什么是确认方法？ 什么是方法确认？什么是方法确认？ 化学检测方法确认需要十个步骤化学检测方法确认需要十个步骤例如例如: 确认一个方法去检测动物组织中抗生素的残留确认一个方法去检测动物组织中抗生素的残留基本情况基本情况 NATA Technical Note 17 (new version) IUPAC Harmonized Guidelines fo

2、r Single Lab. Validation LGC (UK) In-house Method Validation a Guide for Chemical Laboratories标准方法标准方法 Organisation for International Standardisation (ISO) American Society for Testing Materials (ASTM) Association of Official Agricultural Chemists (AOAC) Standards Australia British StandardsPublicat

3、ion of Standard Methods a specialist, core business of the organisations concerned标准方法标准方法 要通过很多实验室的合作研究来确认要通过很多实验室的合作研究来确认.过程慢过程慢 在方法需要与方法建立之间有很长的时间滞后性在方法需要与方法建立之间有很长的时间滞后性方法验证方法验证Method Verification 没有方法确认这么严格没有方法确认这么严格 是否实验室运行都得要专门的标准方法是否实验室运行都得要专门的标准方法?单个实验室方法确认的承认单个实验室方法确认的承认 EU (Decision 2002/

4、657/EU) Codex Committees Methods of Analysis and Sampling Residues of Veterinary Drugs in Foods Pesticide Residues National Regulators APVMA AQIS FSANZ NRS States & Territories 贸易伙伴贸易伙伴Trading Partners 什么是确认方法什么是确认方法? 该方法被证明适用于该目的该方法被证明适用于该目的 使用该方法所测得结果可靠使用该方法所测得结果可靠; 结果合理可用于作决定结果合理可用于作决定什么是方法确认

5、什么是方法确认? 系统评价一个方法，提供客观证据证明该方法能够满系统评价一个方法，提供客观证据证明该方法能够满足特定检测目标的需要。足特定检测目标的需要。 证明该方法是符合证明该方法是符合NATA要求的。要求的。 方法确认方法确认16107893542VALIDATED METHOD61078935421步骤步骤1: 方法的具本要求方法的具本要求为特定明确用途的特殊需求为特定明确用途的特殊需求.需要对所发展的方法需要对所发展的方法的检测对象有的具本要求。的检测对象有的具本要求。什么是方法的需要什么是方法的需要? 你要检测什么你要检测什么? 在什么样品基质中在什么样品基质中? 你需要检测到什么浓

6、度水平你需要检测到什么浓度水平? 对结果你需要有多大可靠性对结果你需要有多大可靠性? 多少浓度范围多少浓度范围? 是否客户还有其它特殊需要是否客户还有其它特殊需要?例如：具本要求例如：具本要求: 动物组织中抗生素残留检测动物组织中抗生素残留检测自由自由化合物化合物 或或 结合化合物结合化合物?仅母体仅母体, 或母体加代谢物或母体加代谢物?特殊动物组织特殊动物组织, 如如. 猪的肾脏猪的肾脏调整检测限调整检测限, 所需的定量限（所需的定量限（ LOQ）?在定量限（在定量限（ LOQ）或）或 MRL值上的可接受的确证限值上的可接受的确证限?样品里的预期浓度样品里的预期浓度?所需的检测周期所需的检测

7、周期?多个的还是单个样品多个的还是单个样品?步骤步骤 1: 方法的具本要求方法的具本要求对这些具本要求的确认将根本定义方法的范围对这些具本要求的确认将根本定义方法的范围步骤步骤 1: 方法的具体要求方法的具体要求为了确认方法的具本要求为了确认方法的具本要求,还有哪些方法的工作特性还有哪些方法的工作特性需要发展呢需要发展呢?以下九个步骤以下九个步骤VALIDATED METHODDEVELOP SPECS6107893542步骤步骤 2: 方法选择性方法选择性在在(与样品一起提取出的与样品一起提取出的)干扰存在下检测结果的准确性干扰存在下检测结果的准确性目标目标: 没有重大干扰没有重大干扰 方法

8、内在的选择性变化方法内在的选择性变化 通过分析含有可能干扰的样品来检查通过分析含有可能干扰的样品来检查例如：方法选择性例如：方法选择性: 动物组织中抗生素的残留检测动物组织中抗生素的残留检测进行系列在日常检测中可能碰到的样品基质试验进行系列在日常检测中可能碰到的样品基质试验用交叉反应法检查用交叉反应法检查(如免疫测定法如免疫测定法)VALIDATED METHODDEVELOP SPECS61078954 SELECTIVITY3步骤步骤 3: 线性范围线性范围对方法而言是用一个计算模型去定义仪器响应与浓度对方法而言是用一个计算模型去定义仪器响应与浓度之间的关系之间的关系通常线性模型由图表表示

9、通常线性模型由图表表示测定线性范围要求测定线性范围要求: 6点校准标样，每点重复测定两次点校准标样，每点重复测定两次 在可能浓度的在可能浓度的0-150% 或或 50-150%严格评价数据严格评价数据, 不要只依赖不要只依赖 r2 值值R2 = 0.984Response vs ConcentrationR2 = 0.98402468101214160102030405060CONCENTRATIONRESPONSE步骤步骤 3: 线性范围线性范围对方法而言是用一个计算模型去定义仪器响应与浓度对方法而言是用一个计算模型去定义仪器响应与浓度之间的关系之间的关系通常线性模型由图表表示通常线性模型由

10、图表表示测定线性范围测定线性范围: 6点校准标样，每点重复测定两次点校准标样，每点重复测定两次 在可能浓度的在可能浓度的0-150% 或或 50-150%严格评价数据严格评价数据, 不要只依赖不要只依赖 r2 值值还要考虑可能的基质效应还要考虑可能的基质效应Response vs Concentration02468100246810CONCENTRATIONRESPONSEwith matrixwithout matrixResponse vs Concentration02468100246810CONCENTRATIONRESPONSE(additive effect)without m

11、atrixwith matrix 例如：线性范围例如：线性范围: 动物组织中抗生素残留检测动物组织中抗生素残留检测 所有方法应用的基本原则所有方法应用的基本原则 检查所有目标化合物的线性检查所有目标化合物的线性 范围覆盖期望浓度的范围覆盖期望浓度的 0150% 清楚基质效应清楚基质效应VALIDATED METHODDEVELOP SPECS6107895 SELECTIVITY LINEARITY4步骤步骤 4: 灵敏度灵敏度响应变化与浓度变化的比例响应变化与浓度变化的比例例如：灵敏度例如：灵敏度: 抗生素在动物组织中的残留检测抗生素在动物组织中的残留检测 可能每天变化可能每天变化 每天例行

12、检查保证满意的灵敏度每天例行检查保证满意的灵敏度 操作时带入部分操作时带入部分QC(质量控制质量控制)样品样品VALIDATED METHODDEVELOP SPECS610789 SELECTIVITY LINEARITY SENSITIVITY5步骤步骤 5: 精确度与准确度精确度与准确度两部分内容两部分内容;精确度精确度; 随机误差随机误差准确度准确度(真实度真实度); 系统误差系统误差 (与真值的偏离与真值的偏离)步骤步骤 5: 精确度与准确度精确度与准确度精确度精确度 重复测定间的预期符合水平重复测定间的预期符合水平精确度的不同测定方法精确度的不同测定方法; 可重复性可重复性 可重现

13、性可重现性 实验室内部的重现性实验室内部的重现性 (通常使用的最好反映通常使用的最好反映)通过对独立准备的合适样品组分重复分析来测定通过对独立准备的合适样品组分重复分析来测定 有典型分析浓度的真实样品有典型分析浓度的真实样品 添加回收添加回收 样品样品 步骤步骤5:精确度与准确度精确度与准确度 准确度准确度 检测结果与真值的接近程度检测结果与真值的接近程度 (或者与公认的参考值的接近程度或者与公认的参考值的接近程度)通过含有已知浓度的样品的重复分析来测定通过含有已知浓度的样品的重复分析来测定; 添加回收添加回收 样品样品或其它不常用方法或其它不常用方法;即通过与已知系统偏差的参考方法来比较即通

14、过与已知系统偏差的参考方法来比较 例如例如:准确度与精确度准确度与精确度: 动物组织中抗生素残留检测动物组织中抗生素残留检测 实验室内检测的重现性实验室内检测的重现性, 更适合用含有已知残留的样品来进行更适合用含有已知残留的样品来进行 回收率通常是重要的指标回收率通常是重要的指标 CRMs 或或 RMs 很难得到很难得到 需要依赖添加回收样品需要依赖添加回收样品 100% 的回收率并不能保证结果的真实性的回收率并不能保证结果的真实性 对样品中含有已知残留物的添加回收很重要对样品中含有已知残留物的添加回收很重要 可能的话通过可能的话通过PT? 确证回收率确证回收率VALIDATED METHOD

15、DEVELOP SPECS10789ACCURACY SELECTIVITY LINEARITYTRUENESS PRECISION SENSITIVITY6步骤步骤 6: 检测限与定量限（检测限与定量限（LOD & LOQ）检测限检测限能可靠检测到的最低浓度能可靠检测到的最低浓度 通常用在一种样品基质中的倍信噪比表示通常用在一种样品基质中的倍信噪比表示定量限定量限能检测到的有可接受不确定度的最低浓度能检测到的有可接受不确定度的最低浓度 通常通常,定量限是检测限的倍定量限是检测限的倍 没必要对所有方法都要有确定的检测限与定量限没必要对所有方法都要有确定的检测限与定量限步骤步骤 6: 检

16、测限与定量限检测限与定量限(LOD & LOQ)检测限检测限 标准溶液的信噪比标准溶液的信噪比(S/N)不是一个适当的计算检测限的方法不是一个适当的计算检测限的方法通过重复分析经过所有测试步骤的样品所得数据统计而得通过重复分析经过所有测试步骤的样品所得数据统计而得例：检测限与定量限例：检测限与定量限: 动物组织中抗生素残留检测动物组织中抗生素残留检测 非常重要典型的残留检测方法非常重要典型的残留检测方法 对确切的目标有详细的要求对确切的目标有详细的要求 对每一个的检测对象有不同的检测限与定量限对每一个的检测对象有不同的检测限与定量限 报告的结果表述为报告的结果表述为“未检出未检出”有重

17、要意义有重要意义NATA 要求对痕量有机物残留进行确证要求对痕量有机物残留进行确证 检测限检测限 = 能被有效检测到与确证的最低浓度能被有效检测到与确证的最低浓度 VALIDATED METHODDEVELOP SPECSLOD&LOQ1089ACCURACY SELECTIVITY LINEARITY SENSITIVITY7TRUENESS PRECISION步骤步骤 7: 线性范围线性范围方法的工作范围，该方法下对结果有一个可接受的不确定方法的工作范围，该方法下对结果有一个可接受的不确定度水平度水平 定量限定量限 线性校正范围的高限（即最下限）线性校正范围的高限（即最下限） 定量

18、限定量限 用在方法确认中的最低浓度用在方法确认中的最低浓度例：线性范围例：线性范围: 动物组织中抗生素残留检测动物组织中抗生素残留检测 定量限定量限 能可靠定量的最低浓度能可靠定量的最低浓度VALIDATED METHODDEVELOP SPECS10RANGE9LOD&LOQACCURACY SELECTIVITY LINEARITY SENSITIVITY8TRUENESS PRECISION步骤步骤 8: 方法适应性方法适应性方法中对微小变化的适应性方法中对微小变化的适应性 象象 pH, 温度温度, 流速流速,试剂浓度试剂浓度, 提取时间等的微小变化的影响提取时间等的微小变化的影

19、响. 方法的发展与实验室内重现性的研究将提醒化学家可能的潜方法的发展与实验室内重现性的研究将提醒化学家可能的潜在影响在影响 可能的影响可以通过一次或同时进行的仔细设计的试验来评可能的影响可以通过一次或同时进行的仔细设计的试验来评估估 介绍限制影响的控制方法介绍限制影响的控制方法例：方法适应性例：方法适应性: 动物组织中抗生素残留检测动物组织中抗生素残留检测 在方法发展中经常在方法发展中经常使用使用在方法发展和或确认中研究任何确定的影响在方法发展和或确认中研究任何确定的影响 必要的话必要的话, 介绍在可接受的限度内减少影响的控制方法介绍在可接受的限度内减少影响的控制方法 方法偏差方法偏差 方法修

20、正方法修正 内标内标VALIDATED METHODDEVELOP SPECS10RANGELOD&LOQACCURACY SELECTIVITY LINEARITY SENSITIVITY RUGGEDNESS9TRUENESS PRECISION步骤步骤 9: 计算不确定度计算不确定度与计算结果关联的一个参数，用于表示所得结果的离差情与计算结果关联的一个参数，用于表示所得结果的离差情况况ISO 17025 和和 NATA要求要求 方法的不确定度知识对结果的比较以及判定结果的合法性或方法的不确定度知识对结果的比较以及判定结果的合法性或调整检测限都是必要的调整检测限都是必要的 好的确认

21、结果会有一个合理的不确定度好的确认结果会有一个合理的不确定度 不确定度的估算对于检测对象及其结果的使用应该是合理的不确定度的估算对于检测对象及其结果的使用应该是合理的例例:方法不确定度估算方法不确定度估算: 抗生素在动物组织中的残留抗生素在动物组织中的残留 估算定量限及其相关控制浓度结果的不确定度估算定量限及其相关控制浓度结果的不确定度 对方法所检测的每一个化合物者估算其结果的不确度对方法所检测的每一个化合物者估算其结果的不确度VALIDATED METHODDEVELOP SPECS MURANGELOD&LOQACCURACY SELECTIVITY LINEARITY SENSI

22、TIVITY RUGGEDNESS10TRUENESS PRECISION步骤步骤 10: 溯源溯源检测结果必须要溯源到一定的标准检测结果必须要溯源到一定的标准,通常是通过完整的关系通常是通过完整的关系链溯源到国家或国际标准链溯源到国家或国际标准,所有的步骤都有相应的不确定度所有的步骤都有相应的不确定度 没有计算不确定度无法溯源没有计算不确定度无法溯源 方法确认对溯源而已是首要步骤方法确认对溯源而已是首要步骤以下是量值溯源图以下是量值溯源图Traceable Chemical Test ResultsPhysical MeasurementsChemical Measurements例例:溯源溯源: 动物组织中抗生素的残留动物组织中抗生素的残留 保证分析所用标准品都被检定过保证分析所用标准