蛋白质基本机构和功能

1、主 要 内 容 蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质 蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化蛋白质(Protein)(Protein)的种类繁多大肠杆菌约含蛋白质3 000种，人体内含蛋白质10万余种。 蛋白质是生命的物质基础1.1.催化功能催化功能2.2.调节功能调节功能3.3.支持功能支持功能4.4.运输功能运输功能5.5.营养功能营养功能6.6.运动功能运动功能7.7.防御功能防御功能8.8.识别功能识别功能9.9.信息传递功能信息传递功能10.10.凝血与抗凝血功能凝血与抗凝血功能 第一节第一节 蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成

2、C 5055% H 67%O 1924%N 1319%S 04%有些蛋白质还含有P、Fe、Cu、Mn、Zn、Se等。各种蛋白质含氮量接近，平均为16%；样品测定中1克氮相当于含6.25克蛋白质（凯氏定氮法） 。一、蛋白质的元素组成二、蛋白质的基本组成单位氨基酸 蛋白质受酸、碱或蛋白酶水解产生游离氨基酸。因此，组成蛋白质的基本单位是氨基酸(amino acid)(amino acid) 。 （一）氨基酸的分类根据R侧链基团的结构和性质的不同，可将2020种氨基酸分为4 4类： 1.1.非极性疏水性氨基酸 2.2.极性中性氨基酸 3.3.酸性氨基酸 4. 4.碱性氨基酸 POLARNON-POLA

3、RTyrHisGlyAcidicNeutralBasicAspGluGlnCysAsnSerThrLysArgAlaValIleLeuMetPheTrpProLeu L-C-C-CONH2-C-CONH2-C-COOH-C-C-COOH-H-CH3-C-OH-C-SH-C-C-S-CPPro-C-C C N N+ -C-C-C-C-NH3+-C-C- -OH-C-NSouth lineCircular lineCentral lineNorthwest lineAliphaticAmideAcidicImino,CircularBasicSulfurHydroxyAromatic-C-C-C-

4、N-C-N N+= C-C-C-C C-C-C-C C C-C C C C HN C-COOH a-C-C OHGln QAsp DGlu EPhe FArg RLys KHis HGly GAAAlaVValI IleSer SThr TCys CTrp WNon-polarPolarArg RTyr YAsn NMet M 氨基酸的等电点（isoelectric point,pI) ) 在某一pH溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的pH称为该蛋白质的等电点。 3 3. .紫外吸收性质 色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸对紫外光有吸 收作用。其最大吸收

5、峰在280280nm附近，以色氨酸吸收最强。 利用此性质可采用紫外分分光度法测定溶液中蛋白质的含量。氨基酸分析仪图解AspThrThrLysGlyGluSerProAlaCysValMetIleLeuTyrPheHisNH3Arg0.20.41.00.60.8光光吸吸收收流出液流出液(mL)15cm柱柱，pH3.25，0.067mol/L柠檬酸钠柠檬酸钠15cm柱柱，pH4.25，0.067mol/L柠檬酸柠檬酸钠钠15cm柱柱，pH5.25，0.12mol/L柠檬酸钠柠檬酸钠缓冲液缓冲液泵泵显色显色反应反应管管茚三酮茚三酮泵泵已分开的已分开的氨基酸氨基酸离子交换柱离子交换柱样品注入口样品注入

6、口记录记录仪仪光电光电倍增倍增管管光源光源（2 2）与亚硝酸反应: :Van Slyke Van Slyke 法测定氨基酸 氨基酸的氨基在室温下与亚硝酸作用，生成氮气。通过在标准条件下测定生成的氮气体积，即可计算出氨基酸的量。 生成的氮气只有一半来自氨基酸。 可用于氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定。三、氨基酸在蛋白质分子中的连接方式（一）肽键和肽肽键（peptide bond)peptide bond)是由一个氨基酸分子的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合形成的化学键。N NC CC C O OH HR R2 2O OH HH HH H+ +肽键肽键-H-H2 2O ON NH H2 2C

7、CC CN NC CCOOHCOOHR R1 1R R2 2O OH HH HH HN NC CC C O OH HR R1 1O OH HH HH HN NH H2 2C C CONHCONH C C CONHCONH C C CONHCONH C C COOHCOOHR R1 1R R4 4R R2 2R R3 3H HH HH HH H主主链链侧链侧链N端N端C端C端命名、编号命名、编号第二节第二节 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构蛋白质是由许多氨基酸单位通过肽键连接形成的具有特定分子结构的高分子化合物。蛋白质的分子结构可分为一级、二级、三级和四级。一级结构是蛋白质的基本结构，二级、三级

8、、四级结构称为高级或空间构象。一、蛋白质的一级结构 概念 是指蛋白质分子中氨基酸的排列顺序。 主要的化学键 肽键、有些蛋白质还含有二硫键。 一级结构是决定蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础，但不是决定蛋白质空间构象唯一因素。 二、蛋白质的空间结构 空间结构 指蛋白质分子内各原子围绕某些共 价键的旋转而形成的各种空间排布及相互关系，称为蛋白质的构象。 蛋白质的构象分为主链构象和侧链构象。（一）蛋白质的二级结构 概念 是指蛋白质多肽链主链原子局部的空间排列，不涉及氨基酸残基侧链的构象。 维系蛋白质二级结构的主要化学键是氢键 2 2. .蛋白质二级结构的主要形式 -螺旋 -折叠 -转角 无规卷曲（

9、1 1） -螺旋-螺旋的结构特点 多肽链以肽键平面为单位，-碳原子为转折点，有规律的盘绕成右手螺旋结构。 每3.6个氨基酸残基盘绕一圈，螺距为0.54nm。 相邻螺旋的肽键之间形成氢键，方向与长轴基本平行，维持螺旋的稳定。 R基团伸向螺旋外侧，其大小、形状及电荷性质均影响-螺旋的形成。（2 2）-折叠 -折叠的结构特点 多肽链呈伸展状态，肽键平面沿长轴折叠呈锯齿状，两平面间夹角为110110，R R基交替地伸向锯齿状结构的上下方。 若干肽段互相靠拢，平行排列，通过氢键连接。氢键的方向与长轴垂直。 若两条肽段走向一致（N N端、C C端方向相同），称为顺向平行；反之，称之为逆向平行，逆向更稳定。

10、-折叠包括平行式和反平行式两种类型 （3 3）-转角 -转角的特点主链骨架本身以大约180回折 回折部分通常由4个氨基酸残基构成 构象依靠第一残基的-CO基与第四残基的- NH基之间形成氢键来维系。 （4 4）无规卷曲 是指多肽链中除了以上几种比较规则的构象外，其余没有确定规律性的那部分肽链构象。 （二）蛋白质的三级结构 概念 是指整条肽链中所有原子的空间排布，它包括主链构象和侧链构象。 主要化学键 疏水键、氢键、盐键等非共价键和二硫键。疏水键是维持三级结构稳定的最主要作用力。结构域（domain） 分子量大的蛋白质在形成三级结构时，肽链中某些局部的二级结构汇集在一起，形成发挥生物学功能的特定

11、区域，称为结构域。 由一条多肽链形成的蛋白质，其最高级结构为三级结构。只有具有三级结构的蛋白质才具有生物学活性。 （三）蛋白质的四级结构 许多蛋白质分子是由两条或两条以上具有独立三级结构的多肽链通过非共价键聚合而成，其中每条具有独立三级结构的多肽链称为亚基。 概念 蛋白质分子中各亚基之间的空间排布和相互接触关系。 化学键 氢键、盐键、范氏引力、疏水键等非共价键。 蛋白质结构中应注意的几个问题 由一条多肽链形成的蛋白质其最高级结构为三级，具有三级结构的蛋白质才具有生物学活性。 形成蛋白质的四级结构至少要有两条多肽链。 两条或两条以上的多肽链靠共价键连接的蛋白质没有四级结构。 由一条多肽链形成的蛋

12、白质与亚基不同。三、蛋白质的结构与功能蛋白质一级结构与功能的关系 一级结构决定蛋白质的空间结构； 一级结构决定蛋白质的生物学功能。 蛋白质空间结构与功能的关系蛋白质构象是其生物学功能的基础， 构象改变功能改变。第三节 蛋白质的理化性质一、蛋白质的两性解离与等电点 1 1. . 蛋白质是两性电解质 蛋白质分子中可解离的基团 多肽两端游离的-氨基和-羧基 多肽侧链R R上解离的基团 决定蛋白质解离成正负离子的因素 蛋白质所含酸性和碱性基团的数目 蛋白质所在溶液的pHpH值2 2. .蛋白质的等电点（pI） 当蛋白质溶液处于某一pHpH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零

13、，此时溶液的pHpH称为蛋白质的等电点。蛋白质等电点性质为电泳分离的依据。 3 3. .电泳带电粒子在电场中向电性相反的电极移动的现象。 蛋白质在带电场中泳动的速度和方向与其所带电荷的性质、数量及分子的大小、形状有关。带电荷多，分子小的泳动速度较快；反之则泳动较慢，从而达到分离蛋白质的目的。 二、蛋白质的胶体性质 1 1. .蛋白质有胶体性质 蛋白质是生物大分子，分子量在1 1万1010万DaDa之间，分子直径在胶体颗粒的范围（1100nm），因此，蛋白质具有胶体的性质。2 2. .蛋白质亲水胶体稳定的因素 蛋白质分子表面的水化膜和同种电荷。去掉两个稳定因素，则蛋白质从溶液中析出而产生沉淀。

14、3 3. .蛋白质胶体性质的应用 透析用于分离纯化蛋白质 超速离心用于蛋白质的分离纯化及分子量的测定。变性的概念 在某些物理或化学因素的作用下，蛋白质特定的空间构象被破坏，从而导致其理化性质改变和生物活性丧失，称为蛋白质的变性。变性的实质 次级键断裂，空间结构破坏 三、蛋白质的变性、沉淀和凝固蛋白质变性的应用 应用变性的因素进行消毒、灭菌。 保存生物制剂则要防止蛋白质变性。牛核糖核酸酶的变性与复性牛核糖核酸酶的变性与复性蛋白质沉淀 概念 蛋白质从溶液中析出的现象称为沉淀。 方法 盐析法、有机溶剂的沉淀、重金属盐沉淀、生物碱试剂及某些酸类沉淀。 变性的蛋白质易于沉淀，但不一定都发生沉淀。沉淀的蛋

15、白质易发生变性，但并不都变性，如盐析。 四、蛋白质的紫外吸收性质 蛋白质分子中含有共轭双键的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸残基，具有紫外吸收能力，在280280nmnm处有最大吸收峰。此特性常用于蛋白质含量的测定。五、蛋白质的免疫学性质 蛋白质作为大分子，往往具有免疫原性，同时，抗体也是蛋白质。 抗原（免疫原）：凡能刺激机体免疫系统产生免疫应答，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞受体发生特异性结合的物质。 抗体：机体中因抗原刺激而产生的能与相应抗原特异结合并具免疫功能的免疫球蛋白。 单克隆抗体：由针对某一个特定抗原决定簇而分化、增殖而来的B B淋巴细胞群合成并分泌的抗体。六、蛋白质的呈色反应1. 1. 双

16、缩脲反应： 肽键与双缩脲试剂反应呈紫色；氨基酸无此反应，可用于检查蛋白质的水解程度。 碱性溶液中与CuCu2+2+反应，mgmg级测定2. 2. 茚三酮反应: : 酸性条件下，与茚三酮共热产生蓝紫色3. Folin3. Folin酚试剂反应 碱性+Cu2+磷钼酸-磷钨酸蓝色 范围:25-250g(Tyr,Trp的反应) 1. 1. 紫外分光光度法: :280nm, 0.1-0.5mg/ml(样品含核酸时)蛋白质(mg/ml)=1.55A280-0.75A2602. 2. 福林- -酚试剂法: :碱性+Cu2+磷钼酸-磷钨酸蓝色范围:25-250g(Tyr,Trp的反应)3. Biuret3.

17、Biuret法： 蛋白质+碱性+Cu2+BCA试剂(4,4-二羧酸-2,2-二喹啉钠)紫色(562nm) 范围:10-1200g/ml4. BradfordBradford蛋白分析法: : 考马斯亮蓝G-250+乙醇+酸性淡红色+蛋白质蓝色(595nm) 范围:10-100g/ml5.双缩脲法 肽键+碱性+Cu2+紫红色 范围:0.5-10mg/ml6.凯氏定氮法 1g氮相当于样品含有6.25g蛋白质第四节第四节 蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化一、蛋白质的提取1. 选材：新鲜、富含目的蛋白且来源方便2. 组织细胞的粉碎：胞内及膜中蛋白 物理法：如超声、匀浆、加砂研磨、高压挤压等 化学法：如E

18、DTA、SDS等 酶法：如自溶法、外加酶法（纤维素酶、果胶酶、溶菌酶等）3. 提取：适当溶媒、适当条件、适当提取时间和次数二、蛋白质的分离纯化（一）根据溶解度不同1. 等电点沉淀:蛋白质在pI时溶解度最小2. 盐析(分级):大量中性盐如(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl加入蛋白质溶液中,破坏蛋白质在水溶液中的稳定性因素而沉淀.各种蛋白质盐析时需盐浓度及pH不同.3. 低温有机溶剂沉淀(分级):降低水的介电常数（二）根据分子大小不同1. 透析和超滤(分级):根据分子量的大小，用透析袋或滤膜将大、小分子物质分开2. 凝胶过滤(分子排阻层析):又称分子筛，柱内填满带有小孔的颗粒，一般为葡聚糖 3. 密度梯度离心:根据粒子密度差进行分离。蔗糖,CsCl( (三) )根据电离性质不同1.电泳法:蛋白质泳动的方向和速度取决于蛋白质分子所带电荷的性质、数量及质点的大小和形状 1)醋酸纤维素薄膜电泳 2)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)2.离子交换层析（如下页图） 1)离子交换纤维素 2)离子交换凝胶 3)大孔型离子交换树脂( (四) )根据配基特异性 亲和层析: 根据生