辛伐他汀对心衰心肌细胞肌浆网钙泵的影响

1、 18只家兔，雌雄不拘，分为只家兔，雌雄不拘，分为3组组假手术组假手术组6只，只，心心力衰竭力衰竭组组 6只，辛伐他汀只，辛伐他汀干预干预组组 6只只(术后即予辛伐他汀术后即予辛伐他汀10mg/kg/d10mg/kg/d，至至实验结束实验结束)。2.实验方法：实验方法：2.1：心衰模型的建立（主动脉瓣损伤：心衰模型的建立（主动脉瓣损伤+ +腹腹主主动脉缩窄法）：动脉缩窄法）：用戊巴比妥麻醉家兔，从右侧颈总动脉用用戊巴比妥麻醉家兔，从右侧颈总动脉用4 4F F导管导管破坏主动脉瓣破坏主动脉瓣。2 2周后，进行腹主动脉缩窄。用戊巴比妥麻周后，进行腹主动脉缩窄。用戊巴比妥麻醉，打开腹腔，在肾动脉上方

2、，将腹主动脉缩醉，打开腹腔，在肾动脉上方，将腹主动脉缩窄窄50%50%左右。左右。观察指标：包括呼吸、活动、进食、紫绀观察指标：包括呼吸、活动、进食、紫绀情况。情况。药物对左室重构的影响药物对左室重构的影响 心脏超声心脏超声观察心脏变化观察心脏变化，观察指标：左房，观察指标：左房内径、左室舒张末径、左室收缩末径、室间隔厚内径、左室舒张末径、左室收缩末径、室间隔厚度、左室后壁厚度、射血分数、左室缩短率。度、左室后壁厚度、射血分数、左室缩短率。 解剖学观察药物对心室重构的影响：观察解剖学观察药物对心室重构的影响：观察心脏心脏重量重量、左心室重量、心脏重量指数、左心室重量、心脏重量指数、左室重、左室

3、重量指数量指数。 血液动力学观察：血液动力学观察：观察左观察左室舒张末压室舒张末压、左、左室收缩末压。室收缩末压。2.2 RT-PCR检测心肌组织检测心肌组织PLB、SERCA2a mRNA表达表达: 抽提抽提mRNA 逆转录逆转录 扩增扩增 SERCA2a 正义引物：正义引物：F-TGAATAAACCGCCTCGG； 反义引物：反义引物：R-CAGCACCATCAGCCACT； PLB 正义引物：正义引物：F-ACTTCCCAGCTACAAGCCCA； 反义引物：反义引物：R-CTGATGTGGGAAATGACGGA； -actin 正义引物：正义引物：F-CTTCTCCTTGATGTCCC

4、GCACGAT ； 反义引物：反义引物：R-GTGCTGTCCCTGTACGCCTCTGG ； 扩增条件为扩增条件为94预变性预变性4min，然后进入，然后进入PCR循环循环,94变性变性30s，55退火退火30s，72延伸延伸1min，循环，循环35次再延伸次再延伸7min。SERCA2a、PLB与与-actin扩增片段长度分别为扩增片段长度分别为464、368、231bp。 电泳电泳 图像分析图像分析 2.3 Western blot检测心肌细胞膜检测心肌细胞膜SERCA2a、细胞浆、细胞浆CaMK、PKA、PP1蛋白表达蛋白表达:提取提取心肌细胞膜心肌细胞膜、细胞浆蛋白、细胞浆蛋白；用用

5、BCA法测定蛋白浓度；法测定蛋白浓度；Western blot分别检测心肌细胞膜分别检测心肌细胞膜SERCA2a蛋白、细胞浆蛋白、细胞浆CaM、CaMK、PKA、PP1蛋白表达蛋白表达。 3 统计分析统计分析 各组测得数值均以各组测得数值均以Xs表示，表示，组间均数比较组间均数比较采用采用ANOVA检验检验 （SAS6.12版本），版本），P0.05为为统计学有显著差异。统计学有显著差异。4.结结 果果4.1 3组观察开始时组观察开始时LAd、IVSD、LVIDd、LVIDs、LVPwd 、FS 、EF比较：比较： 3组家兔手术前组家兔手术前 LAd、IVSd、LVPwd、LVIDd、LVID

6、s 、 FS及及EF无明显差别（无明显差别（p0.05） 4.2 3组观察终止时组观察终止时LAd、IVSD、LVIDd、LVIDs、LVPwd 、FS 、EF比较：比较： 观察终止时心衰组观察终止时心衰组LAd、IVSd、LVPwd、LVIDd、LVIDs较假手术组明显增加较假手术组明显增加（P0.05），而他汀组以上参数较心衰组明显降低（），而他汀组以上参数较心衰组明显降低（P0.05）；心衰组）；心衰组FS及及EF较假手术较假手术组明显降低（组明显降低（P0.05），而他汀组），而他汀组FS及及EF较心衰组明显增加（较心衰组明显增加（P0.05）4.3 3组血流动力学结果比较：组血流动力

7、学结果比较： 3组家兔手术前血流动力学无明显差别；观察终止时，心衰组组家兔手术前血流动力学无明显差别；观察终止时，心衰组HR、LVESP和和LVEDP较假手术组明显增加（较假手术组明显增加（P0.05）；而他汀组以上参数较心衰组明显降低）；而他汀组以上参数较心衰组明显降低（P0.05）4.4 3组心脏、左心室、心脏重量指数组心脏、左心室、心脏重量指数 、左室重量指数比较、左室重量指数比较： 心衰组家兔心脏外观较假手术组明显增大，且心脏重量、左室重量及心脏重量指数、心衰组家兔心脏外观较假手术组明显增大，且心脏重量、左室重量及心脏重量指数、左室重量指数明显增加（左室重量指数明显增加（P0.05）；

8、而他汀组以上参数明显低于心衰组（）；而他汀组以上参数明显低于心衰组（P0.05） 4.5 三组心肌组织三组心肌组织SERCA2a mRNA表达比较表达比较：表表1-6：三组心肌组织：三组心肌组织SERCA2a mRNA表达比较表达比较注：与假手术组比较注：与假手术组比较*P0.05；与心衰组比较；与心衰组比较P0.05。 心衰组的心衰组的SERCA2a mRNA水平显著低于假手术组，而辛水平显著低于假手术组，而辛伐他汀组的伐他汀组的SERCA2a mRNA水平明显高于心衰组。水平明显高于心衰组。 家兔家兔7周后周后SERCA2a mRNA的的表达比较表达比较图图1-1图图1-2 4.6 三组心

9、肌组织三组心肌组织PLB mRNA表达比较：表达比较：表表1-7：三组心肌组织：三组心肌组织PLB mRNA表达比较表达比较注：与假手术组比较注：与假手术组比较*P0.05；与心衰组比较；与心衰组比较P0.05。 心衰组的心衰组的PLB mRNA水平显著低于假手术组，而辛伐他汀水平显著低于假手术组，而辛伐他汀组的组的PLB mRNA水平明显高于心衰组。水平明显高于心衰组。 家兔家兔7周后周后PLB mRNA的水平的水平表达比较表达比较图图1-3图图1-4 4.7 三组心肌组织三组心肌组织SERCA2a蛋白表达比较蛋白表达比较：表表1-8：三组心肌组织：三组心肌组织SERCA2a蛋白蛋白表达比较

10、表达比较注：与假手术组比较注：与假手术组比较*P0.05；与心衰组比较；与心衰组比较P0.05。 心衰组的心衰组的SERCA2a蛋白水平显著低于假手术组，而辛伐蛋白水平显著低于假手术组，而辛伐他汀组的他汀组的SERCA2a蛋白水平明显高于心衰组。蛋白水平明显高于心衰组。 家兔家兔7周后周后SERCA2a蛋白的表达比较蛋白的表达比较 图图1-5 图图1-6 4.8三组心肌组织三组心肌组织CaMK蛋白表达比较蛋白表达比较：表表1-9：三组心肌组织：三组心肌组织CaMK蛋蛋白白表达比较表达比较注：与假手术组比较注：与假手术组比较*P0.05 ；与心衰组比较；与心衰组比较P0.05 。 可见可见心衰组

11、心肌细胞心衰组心肌细胞CaMK表达显著高于假手术组，辛表达显著高于假手术组，辛伐他汀组显著低于心衰组。伐他汀组显著低于心衰组。 家兔家兔7周后周后CaMK蛋白的表达比较蛋白的表达比较 图图1-7 图图1-8 4.9 三组心肌组织三组心肌组织PKA蛋白表达比较蛋白表达比较：表表1-10：三组心肌组织：三组心肌组织PKA蛋白蛋白表达比较表达比较注：与假手术组比较注：与假手术组比较*P0.05 ；与心衰组比较；与心衰组比较P0.05 。 可见可见心衰组心肌细胞心衰组心肌细胞PKA表达显著低于假手术组，辛伐他表达显著低于假手术组，辛伐他汀组显著高于心衰组汀组显著高于心衰组。家兔家兔7周后周后PKA蛋白

12、的表达比较蛋白的表达比较图图1-9图图1-10 4.10 三组心肌组织三组心肌组织PP1蛋白表达比较蛋白表达比较：表表1-11：三组心肌组织：三组心肌组织PP1蛋白蛋白表达比较表达比较注：与假手术组比较注：与假手术组比较*P0.05 ；与心衰组比较；与心衰组比较P0.05 。 可见可见心衰组心肌细胞心衰组心肌细胞PP1表达显著高于假手术组，辛伐表达显著高于假手术组，辛伐他汀组显著低于心衰组他汀组显著低于心衰组。家兔家兔7周后周后PP1蛋白的表达比较蛋白的表达比较 图图1-11图图1-12 4.11 三组心肌组织三组心肌组织CaMK活性活性比较比较：表表1-12：三组心肌组织：三组心肌组织CaM

13、K活性活性比较比较 可见可见心衰组心衰组CaMK活活性明显高于假手术组，辛性明显高于假手术组，辛伐他汀组伐他汀组CaMK活性显活性显著低于心衰组著低于心衰组。图图1-13注：与假手术组比较注：与假手术组比较*P0.05；与心衰组比较；与心衰组比较P0.05。 4.12 三组心肌组织三组心肌组织PKA活性活性比较比较：表表1-13：三组心肌组织：三组心肌组织PKA活性活性比较比较 可见可见心衰组心衰组PKA活性活性明显低于假手术组，辛明显低于假手术组，辛伐他汀组伐他汀组PKA活性显著活性显著高于心衰组高于心衰组。图图1-14注：与假手术组比较注：与假手术组比较*P0.05；与心衰组比较；与心衰组

14、比较P0.05。4.13 肌浆网囊泡的电镜图像：图肌浆网囊泡的电镜图像：图115 4.14 三组心肌组织三组心肌组织SERCA2a活性活性比较比较：表表1-14：三组心肌组织：三组心肌组织SERCA2a活性比较活性比较 可见可见心衰组心衰组SERCA2a活活性明显低于假手术组，辛伐性明显低于假手术组，辛伐他汀组他汀组SERCA2a活性显著活性显著高于心衰组高于心衰组。图图1-16注：与假手术组比较注：与假手术组比较*P0.05；与心衰组比较；与心衰组比较P0.05。 4.15 三组三组心肌细胞肌浆网摄钙能力心肌细胞肌浆网摄钙能力比较比较：表表1-15：三组：三组心肌细胞肌浆网摄钙能力心肌细胞肌

15、浆网摄钙能力比较比较 可见可见心衰组肌浆网摄钙能心衰组肌浆网摄钙能力明显低于假手术组，辛伐力明显低于假手术组，辛伐他汀组肌浆网摄钙能力显著他汀组肌浆网摄钙能力显著高于心衰组高于心衰组。图图1-17注：与假手术组比较注：与假手术组比较*P0.05；与心衰组比较；与心衰组比较P0.05。图图1-18家兔心肌肌浆网外反应液家兔心肌肌浆网外反应液R值变化曲线值变化曲线假手术组假手术组辛伐他汀组辛伐他汀组心衰组心衰组5讨讨 论论 大多数研究表明大多数研究表明SERCA2a在心衰时基因和蛋白表达下降、在心衰时基因和蛋白表达下降、活性降低；活性降低；PLB表达减少。心衰时交感肾上腺素能神经系统兴表达减少。心

16、衰时交感肾上腺素能神经系统兴奋，高浓度儿茶酚胺长期慢性刺激引起心肌奋，高浓度儿茶酚胺长期慢性刺激引起心肌-肾上腺能受体密肾上腺能受体密度下调度下调,cAMP水平降低，水平降低，PKA活性下降，也有研究表明心衰时活性下降，也有研究表明心衰时PKA的表达下降。另外，心衰时的表达下降。另外，心衰时-肾上腺能受体密度下调可以肾上腺能受体密度下调可以引起引起PP1抑制剂活性降低从而导致抑制剂活性降低从而导致PP1的表达和活性的增高。的表达和活性的增高。PKA表达减小、活性降低，表达减小、活性降低，PP1表达增加、活性提高，引起表达增加、活性提高，引起PLB丝氨酸丝氨酸-16位点的磷酸化程度下降，对位点的

17、磷酸化程度下降，对SERCA2a的抑制加的抑制加强，进而导致强，进而导致SERCA2a活性降低，回摄钙离子的能力下降，活性降低，回摄钙离子的能力下降，细胞浆内钙离子增加，心肌的舒张功能降低。在细胞浆内钙离子增加，心肌的舒张功能降低。在SERCA2a活活性降低的情况下，性降低的情况下，NCX(钠钙交换体钠钙交换体)起到代偿作用，起到代偿作用，NCX将细将细胞浆内钙离子转运出细胞增多，胞浆内钙离子转运出细胞增多， 肌浆网回摄和储存钙减少，肌浆网回摄和储存钙减少，影响心肌的收缩功能。影响心肌的收缩功能。 心衰时心衰时PLB对对SERCA2a间接调节作用下降的同时，间接调节作用下降的同时，CaMK的的

18、直接调节作用增加。其表现为直接调节作用增加。其表现为CaMK表达和活性增加。但是表达和活性增加。但是CaMK的过表达又可引起心肌肥厚，进一步加重心力衰竭，形的过表达又可引起心肌肥厚，进一步加重心力衰竭，形成恶性循环成恶性循环。 本实验结果显示心衰组本实验结果显示心衰组SERCA2a、PLB mRNA水平显著下水平显著下降，降，SERCA2a、PKA蛋白表达和活性降低，蛋白表达和活性降低，CaMK和和PP1蛋蛋白表达增加，白表达增加，CaMK活性增加，肌浆网的摄钙能力降低。肌浆活性增加，肌浆网的摄钙能力降低。肌浆网的摄钙能力降低的原因一方面是因为网的摄钙能力降低的原因一方面是因为SERCA2a蛋

19、白表达下降；蛋白表达下降；另一方面是因为另一方面是因为PKA蛋白表达和活性下降以及蛋白表达和活性下降以及PP1蛋白表达增蛋白表达增加可以引起加可以引起PLB的去磷酸化程度增加，进一步引起的去磷酸化程度增加，进一步引起SERCA2a活活性下降。所以性下降。所以SERCA2a活性（下降了活性（下降了44.5）和肌浆网的摄钙）和肌浆网的摄钙能力（下降了能力（下降了43.1）降低的程度较）降低的程度较SERCA2a蛋白表达（下降蛋白表达（下降了了32.4）下降的程度大，并不是与）下降的程度大，并不是与SERCA2a蛋白表达下降的蛋白表达下降的程度平行。程度平行。 研究表明血管紧张素研究表明血管紧张素可

20、以引起心衰大鼠的可以引起心衰大鼠的SERCA2a表表达和功能降低，氯沙坦可以提高心衰大鼠的达和功能降低，氯沙坦可以提高心衰大鼠的SERCA2a表达和表达和功能，群多普利可以提高心衰大鼠的功能，群多普利可以提高心衰大鼠的PLB水平，奥美沙坦能增水平，奥美沙坦能增加心衰大鼠的加心衰大鼠的SERCA2a、PLB和丝氨酸和丝氨酸-16位点磷酸化的位点磷酸化的PLB的表达，都提示心衰时的表达，都提示心衰时RAS系统参与引起了系统参与引起了SERCA2a表达和表达和功能的降低。功能的降低。 研究表明洛伐他汀可以抑制心肌研究表明洛伐他汀可以抑制心肌PP1的表达，提示洛伐他的表达，提示洛伐他汀的作用可以相当于心肌汀的作用可以相当于心肌PP1的抑制剂，抑制心肌的抑制剂，抑制心肌PP1的表