工业发酵菌种选育

1、工业发酵菌工业发酵菌种选育种选育诱变育种诱变育种 以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅1010-6-6-10-10-10-10左右。左右。 诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。* 适于改良品种的个别性状适于改良品种的个别性状* 育种程序简单，年限短育种程序简单，年限短* 变异的方向和性质不定变异的方向和性质不定* 与其它育种方法结合使用，将发挥巨大作用与其它

2、育种方法结合使用，将发挥巨大作用*提高突变率，扩大提高突变率，扩大“变异谱变异谱”、创造新类型、创造新类型诱变育种的意义及特点诱变育种的意义及特点概念概念 以以人工诱变人工诱变手段诱发微生物基因手段诱发微生物基因突变突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，改变遗传结构和功能，通过筛选，从变异体中找出从变异体中找出产量高产量高、性状优良性状优良的突变株，并找出其最佳培养基和最佳的突变株，并找出其最佳培养基和最佳培养条件，使其在最适的环境条见下合成有效产物。培养条件，使其在最适的环境条见下合成有效产物。 诱变育种步骤诱变育种步骤 出发菌株的选择出发菌株的选择 处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备 诱变处理

3、诱变处理 中间培养中间培养 分离和筛选分离和筛选( (一一) )出发菌株的选择出发菌株的选择1自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。2 2在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。3 3每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。 ( (二二) )处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备 诱变育种要求所处理的细胞必须是诱变育种要求所处理的细胞必须是对数生

4、长期对数生长期同步同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液。生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液。 为什么不选择多细胞的菌悬液？为什么不选择多细胞的菌悬液？ 为什么选择对数生长期的菌？为什么选择对数生长期的菌？( (三三) )诱变处理诱变处理 根据后面有关诱变剂及诱变处根据后面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。设计诱变处理方案。( (四四) )中间培养中间培养 由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟表现延迟的过程，即的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程细胞内原有酶量的稀释过程( (

5、生理延迟生理延迟) )，需，需3 3代以上的繁殖才能将突变性状代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。( (五五) )分离和筛选分离和筛选 筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以以量量为主。为主。 复筛则是复筛则是精选精选，以，以质质为主，也就是以为主，也就是以精确度精确度为主。因此在具体方法上就有差异。为主。因此在具体方法上就有差异。（二）诱变育种应注意的问题（二）诱变育种应注意的问题诱变

6、成功的关键：诱变成功的关键： 出发菌株的选择出发菌株的选择 诱变因素的选择诱变因素的选择 诱变剂量的选择诱变剂量的选择 单孢子（或单细胞）悬液的制备单孢子（或单细胞）悬液的制备出发菌株的选择出发菌株的选择1 1自然界自然界新分离的野生型菌株新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。2 2在生产中在生产中经生产选种得到的菌株经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。与野生型较相像，也是良好的出发菌株。3 3已经诱变过的菌株已经诱变过的菌株，再诱变易产生负突变，再度提高产量比较困难，但也有可能会发生正的突变。，再诱变易产生负突变，再

7、度提高产量比较困难，但也有可能会发生正的突变。诱变因素的选择诱变因素的选择 诱变处理方法：物理诱变剂和化学诱变剂诱变处理方法：物理诱变剂和化学诱变剂 主要的诱变剂：紫外线、硫酸二乙酯和亚硝基甲醛尿等。主要的诱变剂：紫外线、硫酸二乙酯和亚硝基甲醛尿等。 诱变方法：单一诱变剂处理诱变方法：单一诱变剂处理 复合诱变剂处理复合诱变剂处理 物理诱变剂：物理诱变剂：射线如紫外线射线如紫外线、X-X-射线、射线、-射线，快中子；射线，快中子； 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小

8、型工厂都适用，也很安全。选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。 其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。专门的设备中使用，否则有一定危险性。化学诱变剂：碱基类似物、化学诱变剂：碱基类似物、5 5氟尿嘧啶、烷化剂等。氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。使用化学诱变剂的优缺点：使用化学诱变剂的优缺点：1 1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。、大多数情况下，就突变数量而言，

9、要比电离辐射更有效。 2 2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射进行工作器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射进行工作时，设备费用大，并要注意安全性。时，设备费用大，并要注意安全性。3 3、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要敏感

10、，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。当心。不同的菌株选用不同的诱变剂！不同的菌株选用不同的诱变剂！ 野生型菌株野生型菌株( (遗传性不稳定遗传性不稳定):):用缓和的诱变剂。用缓和的诱变剂。 遗传性稳定的菌株遗传性稳定的菌株: :先要用强烈的不常用的诱变谱广的诱变剂处理，使其发先要用强烈的不常用的诱变谱广的诱变剂处理，使其发生强烈的变异，然后再用缓和的诱变剂进行处理或多次自然分离。生强烈的变异，然后再用缓和的诱变剂进行处理或多次自然分离。单孢子悬液的制备单孢子悬液的制备细胞的要求：处于对数生长期，并且是均匀状态细胞的要求：处于对数生长期，并且是均匀状态的单细胞悬液。的单细胞悬液。获得单细胞

11、悬液的方法必须要有针对性。获得单细胞悬液的方法必须要有针对性。 例如：诱变霉菌或放线菌时，应处理它们的孢子；诱变芽孢杆例如：诱变霉菌或放线菌时，应处理它们的孢子；诱变芽孢杆菌时，应处理它们的芽孢。菌时，应处理它们的芽孢。（三）常用的物理（三）常用的物理 诱变剂处理方法诱变剂处理方法 紫外线诱变紫外线诱变 紫外线的主要作用紫外线的主要作用 光复活作用光复活作用 光谱范围与有效光谱范围光谱范围与有效光谱范围 40-390nm40-390nm 200-300nm 200-300nm；260nm260nm如何避免光复活作如何避免光复活作用？用？ 紫外线诱变一般采用紫外线诱变一般采用15W15W紫外线杀

12、紫外线杀菌灯灯与处理物的距离为菌灯灯与处理物的距离为151530cm30cm，照射时间依菌种而异，一般，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在量死亡率控制在707080%80%为宜为宜。 被照射的菌悬液细胞数，细菌为被照射的菌悬液细胞数，细菌为106106个个mlml左右，霉菌孢子和酵母细胞为左右，霉菌孢子和酵母细胞为106106107107个个mlml。由于。由于紫外线穿透力紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约不强，要求照射液不要太深，约0.50.51.0cm1.0cm

13、厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。 由于紫外线照射后有由于紫外线照射后有光复活效应光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在，所以照射时和照射后的处理应在红灯红灯下下进行。进行。 ( (二二) )操作步骤操作步骤 1 1将细菌培养液以将细菌培养液以3000r3000rminmin离心离心5min5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。理盐水再离心洗涤。 2 2将菌悬液放入一巳灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将将菌悬液放入一巳灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动

14、，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达细胞液含细胞数可达108108个个mlml左右，作为待处理菌悬液。左右，作为待处理菌悬液。3 3取取2 24m14m1制备的菌液加到直径制备的菌液加到直径9cm9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、然后置磁力搅拌器上、15W15W紫外线下紫外线下30cm30cm处。在正式照射前，应处。在正式照射前，应先先开紫开紫外线外线10min10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式

15、在搅拌下照射，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射101050s50s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。4 4取未照射的制备菌液和照射菌液各取未照射的制备菌液和照射菌液各0.5ml0.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。进行稀释分离，计数活菌细胞数。5 5取照射菌液取照射菌液2ml2ml于液体培养基中于液体培养基中(300ml(300ml三角瓶内装三角瓶内装30ml30ml培养液培养液) )，120r120rminmin振荡培养振荡培养4 46h6h。6 6取中间培养液稀释分离、培养。取中间培养液稀释分离、培养。7 7挑取菌

16、落进行筛选。挑取菌落进行筛选。( (四四) )中间培养中间培养 由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟表现延迟的过程，即的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程细胞内原有酶量的稀释过程( (生理延迟生理延迟) )，需，需3 3代以上的繁殖才能将突变性状代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。诱变因素的选择诱变因素的选择 诱变处理方法：物理诱变剂和化学诱变剂诱变处理方法：物理诱变剂和化学诱变剂 主要的诱变剂：紫外线、硫酸二乙酯和亚硝基甲醛尿等。主要

17、的诱变剂：紫外线、硫酸二乙酯和亚硝基甲醛尿等。 诱变方法：单一诱变剂处理诱变方法：单一诱变剂处理 复合诱变剂处理复合诱变剂处理2 2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射进行工作器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射进行工作时，设备费用大，并要注意安全性。时，设备费用大，并要注意安全性。3 3、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸

18、气，有人对某些诱变剂极其且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。当心。（三）常用的物理（三）常用的物理 诱变剂处理方法诱变剂处理方法 紫外线诱变紫外线诱变 紫外线的主要作用紫外线的主要作用 光复活作用光复活作用 光谱范围与有效光谱范围光谱范围与有效光谱范围 40-390nm40-390nm 200-300nm 200-300nm；260nm260nm如何避免光复活作如何避免光复活作用？用？ 被照射的菌悬液细胞数，细菌为被照射的菌悬液细胞数，细菌为106106个个mlml左右，霉菌孢子和酵母细胞为左右，霉菌孢子和酵母细胞为106106107107个个mlml。由于。由于紫外线穿透力紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约不强，要求照射液不要太深，约0.50.51.0cm1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。 由于紫外线照射后有由于紫外线照射后有光复活效应光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在，所以照射时和照射后的处理应在红灯红灯下下进行。进行。 ( (二二) )操作步骤操作步