细菌学检验技术

1、临床细菌室的基本条件及操作技术细菌实验室完成标本的接种、孵育、分离鉴定和药敏试验等。苏敬良中国农业大学动物医学院临床细菌学实验室必须符合以下条件1. 安装严密的门窗，以防止外部污浊的空气和昆虫进入室内污染环境。室内禁用电扇（根据需要可安装空调）。2. 必须安装有供空气消毒的紫外线灯，置于离工作台面1m 的高度，每天开始工作前照射20分钟。3. 分别备有洗手和标本处理水源及消毒剂水盆。4. 常备消毒剂，对菌液污染的台面和地面进行消毒处理。5. 室内台面每天用消毒剂进行消毒，地面每周至少消毒1次。6. 室内对接收的标本和消毒过的器具要分别指定地点放置，特别是对无菌和有菌器具要明显隔开。用过的试管、

2、平皿必须及时高压灭菌处理。7. 不能或不便高压灭菌的标本和废弃物品必须焚化处理8. 配备必要的消防设备 温箱、高压灭菌设备、CO2培养设备 厌氧培养设备 冰箱、显微镜、离心机、天平、 pH计、 接种器具、火焰灯 各种玻璃器皿、各种塑料器皿孵育温箱 可调温度范围为室温至60，真菌则为25- 26显微镜 普通光学显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜CO2培养设备 CO2培养箱 烛罐（缸 ）3%-5% CO2 化学试剂产气法：按每升体积加枸橼酸0.33g、碳酸氢钠0.37g 两试剂混合于小烧杯置于罐中加入10ml蒸馏水立即将罐封闭。 基本设备和器具厌氧培养设备厌氧箱、厌氧罐和厌氧袋 造成无氧环境有物理方

3、法和化学方法： 物理方法抽气-换气： 真空泵将厌氧罐抽气至负压80-93Pa，然后充入混合气体（CO2 10%、H210% 、N2 80%）或氮气，再抽气换气，反复3次，最后充入混合气体即为无氧环境。 化学方法：在厌氧罐内放盛催化剂的容器，内装化学试剂为硼氢化钠和碳酸氢钠-枸橼酸合剂。在封闭厌氧罐之前，加水到化学试剂中，立即封闭，化学反应产生氢气和CO2。 l物理和化学方法提供的氢气经催化剂钯的作用，与氧气化合成水，把氧除去，造成无氧环境。l厌氧设备中放置氧化还原指示剂，提示是否为无氧状态，如美蓝指示剂，无氧时，指示剂不显颜色，有氧时，为蓝色。接种器具 接种环和接种针：镍铬丝或300W电炉丝制

4、备 火焰灯：煤气灯或酒精等 平皿：60、90、100mm 高压灭菌设备 冰箱和冷藏柜革兰氏染色抗酸染色 碱性复红法（Ziehl-Neelsen法）鞭毛染色墨汁荚膜染色培养基按其性质和用途不同，可以分为以下几类： 基础培养基(basic medium) 含有细菌所需的基本营养成分，可供大多数细菌生长。最常用的基础培养基是肉浸液，即新鲜的牛肉浸出液，加入适当的蛋白胨、氯化钠、磷酸盐，调节pH7.2-7.6。 营养培养基营养培养基(Nutrient medium)(Nutrient medium)在基础培养基中添加一些其它营养物质，如葡萄糖、血液、血清、酵母浸膏、生长因子等可供营养要求较高的细菌生长

5、。又称增菌培养基(Enrichment medium)。 鉴别培养基（鉴别培养基（Differential mediumDifferential medium）利用各种细菌分解糖类和蛋白质的能力及其代谢产物的不同，在培养基中加入特定的作用底物，观察细菌在其生长后分解底物的作用如何，从而鉴别细菌。 选择性培养基（选择性培养基（selective mediumselective medium）在培养基中加入某种化学物质，使之抑制某一类细菌生长，而有利于另一类细菌生长，从而将后者选择出来。 厌氧培养基厌氧培养基(anaerobic medium) (anaerobic medium) 专供厌氧菌的分

6、离、培养和鉴别用 进行厌氧培养的办法，一是将普通培养基放在无氧环境中培养，或者在培养基中加入还原剂以降低培养基的氧化还原电势，并在培养基表面用凡士林或石蜡封住，与空气隔绝，使培养基本身成为无氧的环境，这就是厌氧培养基。如疱肉培养基（cooked meat medium）生化鉴定试验l氨基酸或含氮物质的分解试验l糖类的分解试验l有机酸盐利用试验l生长抑制试验基本诊断血清 沙门氏菌诊断血清 致病性大肠杆菌诊断血清 链球菌Lancefield诊断血清一、建立正确、快速的检验方法 建立正确快速的分离和鉴定方法为达到这一目的，临床细菌室应作到以下几点：1.选择国际公认的分离及鉴定参考方法和试剂作为实验室

7、的常规试验2. 在分离和鉴定的各步骤设立完整的室内质量监控体系3 建立临床菌库 建立正确的药敏试验方法 选择正确的方法 药敏结果的审核和药敏规则的标准化 二、与临床建立密切联系 建立带有评论和注释的细菌学报告 制定标本采集指南和规则 参与治疗方案的制定 获取临床资料 及时将开展新试验、新技术与临床人员沟通。三、 不断提高细菌学基础理论水平实验室前的质量控制 制定标本采集指南 包括标本的采集、运送和采集时间等。 标本接种培养前的质量控制 检查采集的标本是否合格 分离培养的质量控制 标本采集、运送、分离培养基的质量和是否及时接种 培养基的质量控制 常用仪器的质量控制 培养箱、高压灭菌器、细菌鉴定系

8、统、血液分析系统 药物敏感试验的质量控制 染色液及染色方法的质量控制 l校正pH l分装l质量检查 无菌检验、效果检验l保存（1周内）高压蒸汽灭菌压力与温度的关系压力kg/cm2 磅 温度（） 0.35 5 108 0.70 10 116 1.05 15 121 1.40 20 127一、重视标本送检申请单 记录标本的来源、送检的目的、临床诊断（主要症状等），认真做好登记工作。 二、正确采集和处理标本 注意事项 采取血液、脑脊髓液或穿刺液时应严格无菌操作，避免杂菌污染。 粪便、肛拭子、鼻咽拭子应放置与灭菌容器内尽可能避免标本外细菌混入。 应在使用抗菌素前采集标本。 盛标本的容器不得用消毒剂或酸

9、碱类消毒处理。 尽快送检，或根据分离病原的不同保存于适当的温度条件下，如冷冻等。 采集、包装和送检过程中要注意安全采集、包装和送检过程中要注意安全三、选择适宜的培养基是分离出病原菌的重要环节四、认真区分污染菌观察菌落是否在划线上每次培养需要做无菌对照 结合拟培养的细菌生长特点去对照判断（菌落的形状、大小、色泽、边缘、透明度、湿润度、溶血现象等）注意观察培养时间，如布鲁氏菌、支原体、钩体、结核分枝杆菌的生长缓慢。涂片染色检查，观察是否与目的菌一样。分类学的目的分类学的目的在于将所有的生物按其相似性进行归群，并依据各群间的亲缘关系的密切程度排列成一个等级系统，这个系统应尽可能反映各生物种群间自然的

10、系统演化关系，每个种群在这个系统中都应有正确位置。命名命名是按照国际准则给每个物种一个（唯一的）公认的名称鉴定鉴定则是确定一个新分离物的特征，并将其归属于已存在的分类单位的过程Bacteria domain has been subdivided into 23 phyla (28 classes) with the exception of Cyanobacteria and Actinobacteria鉴定细菌的程序和要点鉴定细菌的程序和要点 获得并确论细菌的纯培养； 按照从大（如科或属）到小（如种）及至特异性的范畴顺序测定细菌的各种特性； 正确分析所有有价值的结果以便确定所鉴定细菌的属种

11、可能性； 自始至终用相同的标准进行实验操作和判断结果； 以尽可能少的实验及结果作出细菌鉴定； 必要时通过比较自己分离得到的菌株与标准的参考菌株的实验结果，验证本实验室所作实验条件是否可靠和鉴定方案是否正确。lPURE CULTURES why? if the culture is not pure the results will be a composite from all of the different organisms in the culture and thus can be very misleading.lCriterions of purity similar colon

12、ies exception: S-R variation, capsular variation, pigmented/nonpigmented variation Morphological similarity Purity of culturesRough and smooth colony types of P. luteola after 48 hours. Smooth and Rough Colony Variants of Shigella sonneiGolden pigment-producing staphylococci (left) Pseudomonas aerug

13、inosa colonies on agar Capsule surrounding cells of Streptococcus species 根据生物的共性和特性进行分门别类。将生物的基本特性分为主要和次要，然后依据主次顺序编制双岐图表和检索表，一次一次往下分，指导最小区分单位。由于分类中选择将定力强的生化特征为基础，所以传统分类也成为偏重性鉴定方法。主要一形态特征、培养特征及生理生化特性等表观分类学指征对微生物分类单位进行描述分类细菌的生理、生化特征 1. 细菌的着色性和形态： G-，G+ 球菌、杆菌、弧菌、螺菌等 2. 生物化学特征 根据细菌的营养方式、代谢产物特点和对分子氧的需求，

14、分别将细菌分为氧化型、发酵型和氧化兼发酵型； 厌氧菌、兼性厌氧菌和需氧菌 与传统分类不同，树枝分类以“等重要原则”为理论基础，细菌的生化特征不分主次、总体比较全面分析。选择100-200项生理生化指标，比较结果以相似系数或相似百分数表示。 相似系数=相同特征数/（相同特征数特征+不同特征数 根据相似系数大小，判断细菌种间的亲缘性 数值分类4Numerical taxonomic methods further improved the validity of phenotypic identification by further increasing the numberof tests u

15、sed, usually to 100200, and by calculating coefficientsof similarity between strains and speciesl Although there is no similarity value that defines a taxospecies (species determined by numerical taxonomy), 80% similarity is commonly seen among strains in a given taxospecies.l分子分类 DNA碱基组成（G+C mol%)分

16、析 DNA-DNA分子杂交 DNA指纹技术l1. G+C含量测定l Tm值测定 DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中GC含量越高，Tm值越高，成正比关系。 l评价标准是核酸所吸收的光线量达到其所增加吸收260nm光线的量的两倍达到的温度， l当核酸达到Tm值时，其260nm吸收量可增加百分之四十（紫外吸收量随解体程度而增加，直至完全解体。0.1SSC G+C mol%=2.44Tm-69.31 SSC G+C mol%=2.08Tm-106.4 Ribotyping is a method that can identify and c

17、lassify bacteria based upon differences in rRNA(16S and 23S rRNA). DNA is extracted from a colony of bacteria and then restricted into discrete-sized fragments. The DNA is then transferred to a membrane and probed with a region of the rRNA operon to reveal the pattern of rRNA genes. The pattern is r

18、ecorded, digitized and stored in a database. It is variations that exist among bacteria in both the position and intensity of rRNA bands that can be used for their classification and identification. Random insertion of transposon confirmed by Southern blotDiagram of Southern blot脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析大分子DN

19、A在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”)，不能分离。脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10-2000kb 之间的DNA 片段。这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。利用

20、微生物多种不同的信息，包括表型的、基因型的和系统发育的信息，综合研究微生物分类和系统进化的过程。几乎包括现代分类中所有方面，如传统分类、化学分类、分子分类、数值分类等。 可用于所有水平上的分类单位的描述和定义。l属通常包含具有某些共同特征或关系密切的种。lDNA的G+C mol%10%-12%及16S rRNA的序列同源性95%的种可归为一个属。种和属是一个物种必须具有的属性，一个生物体的名称则是属名加种名的形容词。16S rRNA gene sequencing for bacterialidentification选择16S rRNA gene 的理由： 1、核糖体作为蛋白质合成的必要场所

21、 ， 16S rRNA gene 存在于所有生物的细胞之中并执行相同的功能； 2、具有分子钟特点，分子序列变化缓慢，能跨越整个生命进化过程. 3、分子中含有进化速度不同的区域，可用于进化程度不同的生物的系统发育研究 Woese等根据16SrRNA序列构建的无根宇宙生命进化树ArchaebacteriaBacteriaEukaryaThree Domains ProposallThe rate of change of 16S rRNA gene may not be identical for all organisms (different taxonomic groups could ha

22、ve different rates of change), and the rates could be different at different sites throughout the 16S rRNA gene. There are so-called “hot spots” which show larger numbers of mutationslThe 16S rRNA gene sequence has been determined for a large number of strains. GenBank, the largest databank of nucle

23、otide sequences, has over 20 million deposited sequences, of which over 90,000 are of 16S rRNA gene. This means that there are many previously deposited sequences against which to compare the sequence of an unknown strain.5316S (1.54 kb)The precursor of rRNAtRNA23S(2.9kb)5S(0.12kb)spacersl原核和真核生物的核糖

24、体比较 特性 原核生物 真核生物 大小 70S 80S 小亚基 30S 40S 蛋白质数量 约21 约30 RNA碱基数 16S (1500bp) 18S(2300bp) 大亚基 50S 60S 蛋白质数量 约34 约50 RNA碱基数 23S (2900bp) 28S(4200bp) 5S (120bp) 5.8S(160bp) 5S(120bp)Phylogenetic neighbour-joining tree of the 16 S rRNA gene sequences Bacterial identification based on the phylogenetic analy

25、sis lUniversal primers are usually chosen as complementary to the conserved regions at the beginning of the gene and at either the 540-bp region or at the end of the whole sequence (about the 1,550-bp region), and the sequence of the variable region in between is used for the comparative taxonomy. l

26、化学分类 研究微生物细胞不同的化学特性，并利用这些特性进行分类和鉴定包括细胞壁化学组分、脂肪酸、磷酸类脂、甲基萘醌、全细胞蛋白及核糖体蛋白电泳分析等Gas chromatography-mass spectrometry lUniversal Systems for Identifying a Pure Cultureautomated cellular fatty acid (CFA) analysis 4 saponifying the fatty acids 4 converting them to their volatile methyl esters 4 separating an

27、d quantifying each fatty acid by gas-liquid chromatography. 4 computer compare and calculates the best match or matches for the isolate.Drawbacks:分子分型举例：禽多杀性巴氏杆菌基因分型多位点串联重复序列分析脉冲场凝胶电泳分型和流行病学分析l病毒的分离l 要分离到病毒，首先要采集到含有足够量活病毒的标本，并且要找到敏感的组织或动物。 l 标 本 的 采 集 和 运 送 标 本 的 采 集 和 运 送 s p e c i m e n s p e c i

28、m e n collection,transport collection,transport l 为了保证采集足够量活病毒标本，必须注意三个问题：l1.采集何种标本l一般是根据临床症状、流行病学进行分析、初步推断可能是哪一种病，再决定采集何种标本。l用拭子采集到的标本，应立即浸泡于肉汤中，有的病毒不稳定，如单纯疱疹病毒、流感病毒等，应尽可能早地接种到敏感动物和组织中。l 血液标本有的须加抗凝剂，有的不加，如乙脑病毒主要存在于血清中，全血或血清接种均可；有的病毒主要吸附在白细胞上或红细胞上，因此采血时加抗凝剂可提高分离率。应避免用柠檬酸钠之类的抗凝剂，因动物接种不易耐受。一般是1/1000 的

29、肝素少许或把血液放入含有消毒玻璃球的瓶内震荡脱纤维。l2.采集标本时间l 一般在发病的早期(acute phase),越早越好，晚期体内易产生抗体，病毒成熟释放减少, 分离病毒比较困难。同时晚期可能发生交叉感染，增加判断困难。尸体标本最好在死后6小时内采集，否则病毒容易死亡。l3.标本的运送l由于大多数病毒对热不稳定，以立即接种为好，如需运送或保存,必须在冷的环境,48小时内能送至实验室，一般在50%中性甘油中，4保存最好, 由于冻化过程能使病毒破坏，如需要保存较长时间才能进行检查，最好放在-20以下,干冰或液氮保存。l标本的处理主要有两方面：除菌和将组织标本中的病毒游离出来。 l1.除菌处理

30、l采集标本应尽可能无菌操作，但有些标本，如大便、鼻拭子等，本身常带杂有大量的细菌必须除菌。l抗生素处理。抗生素的浓度及作用时间视标本而定，4过夜。l可以10000r/min离心20分钟，大部分细菌和杂质可以去除l对乙醚有抵抗的病毒如肠病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等可以加等量乙醚4过夜除菌。 l2.研磨和稀释l 用脑、脊髓等组织作为分离病毒的标本时，为了游离细胞内病毒，应该在研磨器充分研磨。稀释液常用pH7.2-7.6的肉汤、10%脱脂奶生理盐水、0.5%水解乳蛋白Hanks液，将组织制成10%悬液，中性甘油保存的标本，如果需要作脑内注射，应以生理盐水洗2-3次在研磨，磨好的标本20

31、00r/min离心20分钟，用上清液接种动物和细胞。如果怀疑有细菌污染，应该在除菌处理。 l 标本接种于哪一种动物、鸡胚或细胞，以及选择哪一种途径，主要决定于病毒的嗜性。一般嗜神经性病毒主要动物脑内接种；嗜呼吸道病毒接种动物鼻腔及鸡胚尿囊腔；嗜皮肤性病毒接种动物皮内、皮下或鸡胚绒毛尿囊膜；嗜内脏病毒可接种动物的腹腔、静脉、肌肉等。近年来，由于组织培养技术的广泛应用，多数病毒都能够用组织培养进行分离鉴定。l1.动物接种l 主要观察有无发病症状。l 用动物分离病毒，要注意动物本身的病毒被分到的可能，即应该排除动物自发性病毒的可能。所以对实验动物的健康状况应该有所了解。尽量选用级别较高的实验动物。l2.鸡胚接种l 鸡胚羊膜腔和尿囊腔分离病毒，一般是测定其血凝素的产生，如流感病毒、新城疫病毒；绒毛尿囊膜接种主要观察其痘斑。卵黄囊接种主要观察鸡胚的死亡。 l3.组织培养上的表现l 病毒感染可以引起特殊的细胞病变可以归纳为5种类型l肠道病毒 细胞圆缩、小、分散、不聚集、全部细胞受破坏l 腺病毒 细胞肿大、颗粒增多、病变细胞聚集成葡萄状l 虫媒病