第一节遗传变异的物质基础第二节质粒第三节基因突变的规律

1、第一节 遗传变异的物质基础第二节 质粒第三节 基因突变的规律及类型1. 突变的定义2.基因突变的特点(规律)自发性不对应性独立性稀有性可诱变性稳定性可逆性3.证明基因突变自发性和不对应性的实验证据4.基因突变的类型第四节 基因突变的机制1.基因突变的分子基础自发突变诱发突变(化学诱变/物理诱变/生物诱变)二、诱变及化学致癌物质的检测二、诱变及化学致癌物质的检测Ames试验试验“生物化学统一性生物化学统一性”法则：法则： 人和细菌在人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的的结构及特性方面是一致的，能使微生，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使

2、其发生使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。突变，最后造成癌变或其他不良的后果。Ames试验的依据试验的依据诱变剂的共性原则：诱变剂的共性原则： 化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比。化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比。回复突变回复突变(reverse mutation或或back mutation)： 突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变。得到恢复，这种第二次突变称为回复突变。美国加利福尼亚大学的美国加利福尼亚大学的Bruce Ames教授于教授于1966年发明，年发明，因此称为因

3、此称为Ames试验试验标准菌株要求：标准菌株要求： 检测检测鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺组氨酸营养缺陷型菌株陷型菌株(his-)的回复突变率的回复突变率（为了增加试验的敏感性，该菌株（为了增加试验的敏感性，该菌株还应包括另外两个突变，一个是造成细胞表面透性增加的深度还应包括另外两个突变，一个是造成细胞表面透性增加的深度粗糙突变型，另一个是丧失切除修复能力的缺失型）。粗糙突变型，另一个是丧失切除修复能力的缺失型）。Ames试验三、三、DNA损伤的修复损伤的修复 除了除了DNA聚合酶进行校正外，还通过几种不同的机制聚合酶进行校正外，还通过

4、几种不同的机制进行进行DNA的修复：的修复： (1) 光复活作用光复活作用 (2) 切除修复切除修复 (3) 重组修复重组修复 (4) SOS修复修复 紫外线诱变时必须在暗室、红光下进行紫外线诱变时必须在暗室、红光下进行（1）光复活作用（）光复活作用（photoreactivation）可见光可大大降低经紫外线照射后微生物死亡率的现象。可见光可大大降低经紫外线照射后微生物死亡率的现象。机理：机理： 经经UV照射后带有嘧啶二聚体的照射后带有嘧啶二聚体的DNA分子，在黑暗中会分子，在黑暗中会和一种光激活酶和一种光激活酶光解酶结合，形成酶光解酶结合，形成酶 DNA复合物，复合物，该复合物暴露在可见光

5、下时，光解酶会因获得光能而被激该复合物暴露在可见光下时，光解酶会因获得光能而被激活，并使二聚体重新分解成单体，光解酶也从复合物中释活，并使二聚体重新分解成单体，光解酶也从复合物中释放出来，再结合到其它二聚体上。放出来，再结合到其它二聚体上。 这种修复机制不是移去和取代核苷酸，而是胸腺嘧啶二聚体直接被修复，所以是一种无错误的修复。（2）切除修复（）切除修复（excision repair，又称暗修复）又称暗修复）一种普遍的修复系统。能移去胸腺嘧啶二聚体和修复大多数引起的DNA扭曲损伤。该修复系统不需要可见光，通过酶切作用移去损伤的碱基（包括损伤位点附近的一些碱基），随后合成一段正常DNA链。 内

6、切核酸酶 4种酶参与种酶参与 外切核酸酶 DNA聚合酶 DNA连接酶（3）重组修复）重组修复这是一种越过损伤而进行的修这是一种越过损伤而进行的修复。这种修复不将损伤的碱基复。这种修复不将损伤的碱基除去，而是通过复制后，经除去，而是通过复制后，经染染色体交换，使子链上的空隙部色体交换，使子链上的空隙部位不再面对着嘧啶二聚体，而位不再面对着嘧啶二聚体，而是面对着正常的单链，在这种是面对着正常的单链，在这种情况下，情况下，DNA聚合酶和连接酶聚合酶和连接酶便能起作用，把空隙部分进行便能起作用，把空隙部分进行修复。留在亲链上的二聚体仍修复。留在亲链上的二聚体仍要依靠再一次的切除修复加以要依靠再一次的切

7、除修复加以除去，或经细胞分裂而稀释掉除去，或经细胞分裂而稀释掉。 (4) SOS修复修复 这是在DNA分子受到较大范围的重大损伤时诱导产生的一种应急反应。涉及几个基因：recA、lexA、uvrA、uvrB、uvrC的共同作用。 此外，经紫外线照射的大肠杆菌还可能诱导产生一种称为错误倾向（error-prone）的DNA聚合酶，催化空缺部位的DNA修复合成，但由于它们识别碱基的精确度低，所以容易造成复制的差错，这是一种以提高突变率来换取生命存活的修复，又称错误倾向的SOS修复。 第五节 微生物的诱变育种一、诱变育种中的几个原则一、诱变育种中的几个原则 指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，

8、促进其突变指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变率显著提高，然后设法从中选取少数符合育种目的的突变株。率显著提高，然后设法从中选取少数符合育种目的的突变株。2个主要环节：个主要环节：诱变（随机）诱变（随机）选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀、分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞、分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中的突变频率大大致死的同时，使存活个体中的突变频率大大提高。提高。筛选（定向）筛选（定向）设计有效的筛选方法，将少量正变株中的设计有效的筛选方法，将少量正变株中的优良菌株挑选出来。优良菌株挑选出来。（一）（

9、一） 出发菌株（出发菌株（original strain）出发菌株出发菌株指用于诱变育种的起始菌株。指用于诱变育种的起始菌株。 具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、 标记明显等）；标记明显等）； 对诱变剂敏感对诱变剂敏感野生型菌株；野生型菌株；从生产中选育的自发突变菌株；从生产中选育的自发突变菌株；诱变获得的高产菌株诱变获得的高产菌株出发菌株的选择标准：出发菌株的选择标准：出发菌株的来源：出发菌株的来源：（二）（二） 菌悬液的制备菌悬液的制备1. 选用单细胞或单孢子悬液选用单细胞或单孢子悬液（均匀、分散）（均匀、分散）目的：目的：使每

10、个细胞能均匀接触诱变剂；使每个细胞能均匀接触诱变剂； 减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象）减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象）2. 同步培养同步培养（生理状态一致）（生理状态一致）3. 菌龄：对诱变剂最敏感时期菌龄：对诱变剂最敏感时期 营养细胞：对数期营养细胞：对数期 孢子或芽孢：萌发前期孢子或芽孢：萌发前期4.4.菌悬液的制备方法菌悬液的制备方法 物理诱变：生理盐水配制物理诱变：生理盐水配制 化学诱变：缓冲液配制化学诱变：缓冲液配制5. 菌悬液的浓度菌悬液的浓度 酵母菌，霉菌的孢子：酵母菌，霉菌的孢子：10106 6个个/ /mLmL 细菌，放线菌孢子：细菌，放线菌孢子：

11、10108 8个个/ /mLmL （三）诱变剂的选择及处理方法（三）诱变剂的选择及处理方法1. 诱变剂的选择（诱变剂的选择（高效，简便高效，简便） 物理诱变剂：物理诱变剂：频度低、大损伤，难修复，且操作简便；频度低、大损伤，难修复，且操作简便； 化学诱变剂：化学诱变剂：频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。 ( NTG超诱变剂）超诱变剂）UV是最常用的一种诱变剂是最常用的一种诱变剂2. 剂量的选择剂量的选择 突变率随剂量的增加而提高，但到达一定程度后，再提突变率随剂量的增加而提高，但到达一定程度后，再提高剂量高剂量, 反而会使突变率下降。反而会使突变率下降

12、。 正变较多出现在偏低剂量中，而负变较多出现在偏高剂正变较多出现在偏低剂量中，而负变较多出现在偏高剂量中。量中。 在产量变异工作中，常采用相对杀菌率为在产量变异工作中，常采用相对杀菌率为7075%, 甚至甚至3070%的剂量的剂量。 UV的剂量: 固定UV功率和照射距离,以照射时间长短来确定剂量多少。最适剂量：最适剂量：在提高突变率的基础上，既能扩大变异幅度，在提高突变率的基础上，既能扩大变异幅度， 又能使变异向正突变范围移动的剂量。又能使变异向正突变范围移动的剂量。常以杀菌率来表示相对剂量（剂量-存活率曲线）3. 诱变处理方法诱变处理方法单因素处理或多因素的复合处理：单因素处理或多因素的复合

13、处理：同一诱变剂的重复使用；同一诱变剂的重复使用；两种或多种诱变剂的先后使用；两种或多种诱变剂的先后使用；两种或多种诱变剂的同时使用两种或多种诱变剂的同时使用. .（四）（四） 中间培养（中间培养（CM，培养过夜）培养过夜）目的：目的：克服表型延迟克服表型延迟表型延迟表型延迟（phenotypic lag）：表型的改变落后于基因型改变的表型的改变落后于基因型改变的 现象现象. 分离性延迟：分离性延迟： 突变的基因经突变的基因经DNA复制和细胞分裂后变成纯复制和细胞分裂后变成纯 合状态，表型才能表现出来合状态，表型才能表现出来。 生理性延迟：生理性延迟： 由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能由

14、杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能 表现出来。表现出来。分离性延迟的原因分离性延迟的原因: 对数生长期中，单核细胞常出现双核对数生长期中，单核细胞常出现双核现象，多核细胞的核也成倍增加，诱变对数期的细胞时，突现象，多核细胞的核也成倍增加，诱变对数期的细胞时，突变通常发生在一个核上，故其变异或非变异的细胞必须经过变通常发生在一个核上，故其变异或非变异的细胞必须经过一代或几代繁殖才能分离，这种纯种变异细胞出现的推迟现一代或几代繁殖才能分离，这种纯种变异细胞出现的推迟现象称为分离延迟现象。象称为分离延迟现象。生理性延迟的原因生理性延迟的原因: 当变异细胞由杂合状态变为纯合状态当变异细胞由杂合状态变

15、为纯合状态时时, ,由于杂合期所合成的非变异的蛋白或酶仍然发挥作用由于杂合期所合成的非变异的蛋白或酶仍然发挥作用, ,必必须经过细胞多代分离后须经过细胞多代分离后, ,才能将这些非变异的酶稀释掉才能将这些非变异的酶稀释掉, ,最终最终达到变异后应该表现的形态达到变异后应该表现的形态, ,如营养缺陷型突变株的筛选过如营养缺陷型突变株的筛选过程。程。 生理性延迟生理性延迟:（五）突变株的筛选（五）突变株的筛选 初筛初筛 复筛复筛1. 初筛（以量为主）初筛（以量为主）（1 1）利用形态变异：）利用形态变异：需预先测定形态与产量的相关性需预先测定形态与产量的相关性（2 2）根据平板颜色反应直接挑选）根

16、据平板颜色反应直接挑选 透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）；透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）； 抑菌圈法（抗生素）；抑菌圈法（抗生素）； 变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）；变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）； 沉淀圈法（外毒素）沉淀圈法（外毒素）透明圈直径（透明圈直径（H H）/ /菌落直径（菌落直径（C C）：）：产量高低（初筛指标）产量高低（初筛指标）2. 复筛（以质为主，定量测定）复筛（以质为主，定量测定）摇瓶培养，直接检测所需产物摇瓶培养，直接检测所需产物方法需简便、快速2步步诱变育种的基本原则：诱变育种的基本原则： 选择简便有效的诱变剂；选择简便有效的诱变剂； 挑选优良的

17、出发菌株；挑选优良的出发菌株； 处理单细胞或单孢子悬液；处理单细胞或单孢子悬液； 选用最适的诱变剂量；选用最适的诱变剂量； 充分利用复合处理的协同效应；充分利用复合处理的协同效应； 利用和创造形态、生理与产量间的相关指标；利用和创造形态、生理与产量间的相关指标； 设计高效筛选方案；设计高效筛选方案； 创造新型筛选方法。创造新型筛选方法。二、几种重要突变株的筛选方法二、几种重要突变株的筛选方法 1. 抗性突变株的筛选抗性突变株的筛选 (1) 抗终代谢物结构类似物突变株的筛选抗终代谢物结构类似物突变株的筛选 (2) 抗药性突变株筛选抗药性突变株筛选 2. 营养缺陷型的筛选营养缺陷型的筛选 1. 抗

18、性突变株的筛选抗性突变株的筛选 （1）抗终代谢物结构类似物的突变株）抗终代谢物结构类似物的突变株 用途：筛选相应代谢物的高产菌株用途：筛选相应代谢物的高产菌株 （2）抗药性突变株）抗药性突变株 用途：筛选相应药物用途：筛选相应药物(抗生素抗生素) 的高产菌株或遗传标记制作的高产菌株或遗传标记制作 筛选的方法筛选的方法: a. 高于临界浓度的平板进行分离； b. 梯度平板法 敏感敏感菌苔菌苔 抗性抗性菌落菌落加入含异烟肼的上层加入含异烟肼的上层 加入不含异烟肼的底层加入不含异烟肼的底层 所谓结构类似物（又称代谢拮抗物）是指那些在结构上和代谢终产物（氨基酸、嘌呤、维生素等）相似的物质。 如：异烟肼

19、（“雷米封”）是吡哆醇的结构类似物，利用含异烟肼梯度平板筛选异烟肼抗性突变株，可达到定向培育吡哆醇高产突变株的目的。 为什么在筛选突变株时,不能直接用代谢产物,而必须用其结构类似物?2. 营养缺陷型突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选（1）几个概念：）几个概念：三类培养基：三类培养基：基本培养基（基本培养基（MM, minimal mediumMM, minimal medium）-：某野生型能生长的最低成分的组合培养基。某野生型能生长的最低成分的组合培养基。完全培养基（完全培养基（CM,complete mediumCM,complete medium）+：各种营养缺陷型能生长的天然或半组合培

20、养基各种营养缺陷型能生长的天然或半组合培养基补充培养基（补充培养基（SM, supplemental mediumSM, supplemental medium）A:-+AA:-+A B:-+B B:-+B相应营养缺陷型能生长的组合或半组合培养基相应营养缺陷型能生长的组合或半组合培养基三种遗传型：三种遗传型：野生型（野生型（wild typewild type） 从自然界分离到的、发生营养缺陷型突变前的原始菌株。从自然界分离到的、发生营养缺陷型突变前的原始菌株。 A A+ +B B+ +, 可在可在-生长。生长。营养缺陷型（营养缺陷型（auxotrophauxotroph） 野生型菌株经诱变剂

21、处理后，由于发生了丧失某种酶合成能野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某种酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变菌株突变菌株（主要指合成维生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力）（主要指合成维生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力）。 A A+ +B B- - ：能在能在+、 BB生长生长 A A- -B B+ + ：能在能在+、 AA生长生长 A A- -B B- - ：能在能在+生长生长原养型（原养型（prototrophprototroph） 营养缺陷型经回复突变或重组，回到原来野生型的营养要求营养缺陷型经回复突变

22、或重组，回到原来野生型的营养要求 A A+ +B B+ +, 可在可在-生长生长（2）筛选步骤（）筛选步骤（5步）步）诱变处理诱变处理中间培养中间培养淘汰野生型淘汰野生型检出缺陷型检出缺陷型鉴定缺陷型鉴定缺陷型中间培养中间培养CMCM或或SMSM培养基培养基，培养过夜培养过夜。克服表型延迟。克服表型延迟。淘汰野生型淘汰野生型即浓缩缺陷型，以提高检出率即浓缩缺陷型，以提高检出率方法方法 抗生素法抗生素法（G G+ +细菌细菌：青霉素；青霉素；酵母菌和霉菌：酵母菌和霉菌：制霉菌素）制霉菌素） 菌丝过滤法菌丝过滤法（丝状真菌、放线菌）（丝状真菌、放线菌） 饥饿培养（无饥饿培养（无N N）MM 6 6

23、12 h12 h 2N 2N培养培养(2(2N)MMN)MM 1 12 h2 h 加抗生素加抗生素( (或菌丝过滤或菌丝过滤) )，培养过夜，培养过夜 营养缺陷型的检出营养缺陷型的检出方法逐个检出法夹层培养法限量补充培养法影印平板法 营养缺陷型的鉴定营养缺陷型的鉴定生长谱法：生长谱法：快速，直观快速，直观分两步：分两步：a.a.三大类营养要求（氨基酸、维生素、核苷酸）的鉴定三大类营养要求（氨基酸、维生素、核苷酸）的鉴定b.b.具体到某一种营养要求的鉴定具体到某一种营养要求的鉴定( (哪一种氨基酸哪一种氨基酸, ,哪一种哪一种 维生素维生素, ,或哪一种碱基或哪一种碱基) )具体操作具体操作: :一