生物化学课件-蛋白质及其分离纯化

1、第一章蛋白质化学蛋白质化学1.11.1蛋白质的功能蛋白质的功能1.21.2蛋白质的分类蛋白质的分类1.31.3蛋白质的组成蛋白质的组成1.41.4蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构1.51.5蛋白质的性质蛋白质的性质1.61.6蛋白质的分离纯化与鉴定蛋白质的分离纯化与鉴定1.1蛋白质的功能1) 催化功能：催化功能：酶蛋白酶蛋白2) 结构功能：结构功能：胶原蛋白、角蛋白胶原蛋白、角蛋白3) 运输功能：运输功能：血红蛋白、载脂蛋白血红蛋白、载脂蛋白4) 贮存功能：贮存功能：卵清蛋白卵清蛋白5) 运动功能：运动功能：肌动蛋白、肌球蛋白、鞭毛蛋白肌动蛋白、肌球蛋白、鞭毛蛋白6) 防御功能防御功能7) 调

2、节功能：调节功能：激素类蛋白激素类蛋白8) 信息传递功能：信息传递功能：膜蛋白、味觉蛋白膜蛋白、味觉蛋白9) 遗传调控功能遗传调控功能10)其他功能其他功能1.2蛋白质的分类蛋白质的分类P4按分子形状分类按分子形状分类球状蛋白球状蛋白纤维状蛋白纤维状蛋白按分子组成分类按分子组成分类简单蛋白：简单蛋白：无非蛋白成分无非蛋白成分结合蛋白：结合蛋白：蛋白质非蛋白成分蛋白质非蛋白成分简单蛋白质按溶解度不同分类：简单蛋白质按溶解度不同分类：结合蛋白质依据辅基不同分类：结合蛋白质依据辅基不同分类：1.3蛋白质的组成1.3.1蛋白质的元素组成蛋白质的元素组成C、H、O、N、（、（S、P及一些金属元素）及一些

3、金属元素）特点：特点：蛋白质中氮含量较为恒定，约蛋白质中氮含量较为恒定，约为为16%16%，且在糖及脂类中不含氮，且在糖及脂类中不含氮凯氏定氮法：蛋白质含量含氮量凯氏定氮法：蛋白质含量含氮量6.256.251.3.2蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成 蛋白质的水解蛋白质的水解蛋白质蛋白质肽段肽段氨基酸氨基酸 氨基酸的结构氨基酸的结构 氨基酸的分类氨基酸的分类 氨基酸的性质氨基酸的性质 氨基酸的分离和分析方法氨基酸的分离和分析方法 肽及肽键肽及肽键1、蛋白质的水解酸水解：酸水解：常用常用HCl及及H2SO4水解水解优点：水解完全，不引起消旋优点：水解完全，不引起消旋缺点：部分氨基酸被破坏缺点：部分

4、氨基酸被破坏碱水解：碱水解：常用常用 NaOH水解水解优点：水解完全，色氨酸不被破坏优点：水解完全，色氨酸不被破坏缺点：多数氨基酸被破坏，并产生消旋缺点：多数氨基酸被破坏，并产生消旋酶水解酶水解优点：不破坏氨基酸，不引起消旋优点：不破坏氨基酸，不引起消旋缺点：水解时间长，单一酶水解不完全缺点：水解时间长，单一酶水解不完全2、基本氨基酸的结构 构成蛋白质的基本氨基酸共构成蛋白质的基本氨基酸共2020种。种。 共同点：除脯氨酸外，均为共同点：除脯氨酸外，均为-氨氨基酸，即同一碳原子上有羧基、氨基酸，即同一碳原子上有羧基、氨基与氢。基与氢。 不同点：侧链不同点：侧链R R基团不同。基团不同。3、氨基

5、酸的分类蛋白质氨基酸蛋白质氨基酸1）20种基本氨基酸种基本氨基酸按侧链极性分类按侧链极性分类按侧链结构分类按侧链结构分类 按人体能否合成分类按人体能否合成分类2）稀有氨基酸）稀有氨基酸非蛋白质氨基酸非蛋白质氨基酸按侧链结构分类按侧链结构分类脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸(15种种)芳香族氨基酸芳香族氨基酸(3种种)杂环氨基酸杂环氨基酸(2种种)芳香族氨基酸芳香族氨基酸(3种种)杂环氨基酸（杂环氨基酸（2种）种）按侧链按侧链R基团极性分类：基团极性分类：非极性非极性(疏水疏水)氨基酸氨基酸(9种种)极性不带电荷氨基酸极性不带电荷氨基酸(6种种)极性带正电荷氨基酸极性带正电荷氨基酸(碱性氨基酸碱性氨基酸

6、)(3种种)极性带负电荷氨基酸极性带负电荷氨基酸(酸性氨基酸酸性氨基酸)(2种种)非极性非极性(疏水疏水)氨基酸（氨基酸（9种）种）极性极性不带不带电荷电荷氨基氨基酸酸(6(6种种) )极性带正电荷氨基酸（极性带正电荷氨基酸（3 3种）种）极性带负电荷氨基酸（极性带负电荷氨基酸（2 2种）种） 按人体能否合成分类 必需氨基酸：必需氨基酸：机体不能自身合成，必须机体不能自身合成，必须由食物供给的氨基酸由食物供给的氨基酸 人体必需氨基酸有八种：人体必需氨基酸有八种： Met Trp Lys Val Ile Leu Phe Thr “假假 设设 来来 借借 一一 两两 本本 书书”半必需氨基酸：半必

7、需氨基酸：人体可合成，但合成量人体可合成，但合成量不足，如精氨酸及组氨酸。不足，如精氨酸及组氨酸。非必需氨基酸：非必需氨基酸：可自身合成且能满足需可自身合成且能满足需要的氨基酸（要的氨基酸（10种）种）2）不常见的蛋白质氨基酸）不常见的蛋白质氨基酸由常见氨基酸经酶催化，通过化学修饰转化而来 非蛋白质氨基酸非蛋白质氨基酸3、氨基酸的性质物理性质物理性质 吸收光谱性质吸收光谱性质两性解离性质与等电点两性解离性质与等电点化学反应化学反应 物理性质-氨基酸为无色晶体，熔点较高。氨基酸为无色晶体，熔点较高。一般情况下，大多数氨基酸溶解于水而不一般情况下，大多数氨基酸溶解于水而不溶于有机溶剂溶于有机溶剂(

8、 (除半胱氨酸和酪氨酸外，其除半胱氨酸和酪氨酸外，其他氨基酸一般均能溶于水、稀酸、稀碱；除他氨基酸一般均能溶于水、稀酸、稀碱；除脯氨酸外，其他氨基酸一般均不能溶于有机脯氨酸外，其他氨基酸一般均不能溶于有机溶剂溶剂) )。紫外吸收光谱性质紫外吸收光谱性质 构成蛋白质的构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均均有光吸收。有光吸收。 在近紫外区在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力 由于大多数蛋白质都含有这些氨基酸残由于大多数蛋白质都含有这些氨

9、基酸残基，因此用紫外分光光度法可测定蛋白基，因此用紫外分光光度法可测定蛋白质含量。质含量。紫外紫外吸收光吸收光谱性质谱性质补充：补充： 两性解离性质及等电点氨基酸的等电点氨基酸的等电点(pI)：氨基酸的净氨基酸的净电荷为零时所处溶液的电荷为零时所处溶液的pH值。值。意义：意义：氨基酸处于等电点时，其溶解氨基酸处于等电点时，其溶解度最小，最易沉淀，此性质常用于度最小，最易沉淀，此性质常用于分离制备特定的氨基酸。分离制备特定的氨基酸。甘甘氨氨酸酸的的解解离离曲曲线线补充：补充：氨基酸氨基酸pI值的计算值的计算pKpK值（解离常值（解离常数）数）：指某种：指某种解离基团有一解离基团有一半被解离时的半

10、被解离时的pHpH值值pI=(pK1+pK2)/2化学反应化学反应1）与茚三酮的反应 -氨基酸氨基酸与水合茚三酮溶液共热，引与水合茚三酮溶液共热，引起氨基酸氧化脱氨、脱羧，水合茚三酮与起氨基酸氧化脱氨、脱羧，水合茚三酮与反应产物（氨、还原型茚三酮）生成反应产物（氨、还原型茚三酮）生成兰紫兰紫色产物色产物（脯氨酸脯氨酸Pro和羟脯氨酸和羟脯氨酸Hyp呈呈黄黄色色），色深与溶液中氨基浓度成正比。），色深与溶液中氨基浓度成正比。 还原茚三酮还原茚三酮2）与亚硝酸反应）与亚硝酸反应脯氨酸不参加此反应。应用：测定氨基酸含量 测定蛋白质的水解程度3）与甲醛反应）与甲醛反应反应：反应： 氨基酸与甲醛反应生成

11、羟甲基、二氨基酸与甲醛反应生成羟甲基、二羟甲基氨基酸，同时释放羟甲基氨基酸，同时释放H+。应用：应用： 可以酚酞作指示剂，用可以酚酞作指示剂，用NaOH滴定，滴定，测定氨基酸含量或判断蛋白质水解或合测定氨基酸含量或判断蛋白质水解或合成进度，此法称为成进度，此法称为甲醛滴定法甲醛滴定法。1.4.1 蛋白质的结构层次1. 基本结构：一级结构2. 三维结构：高级结构1) 二级结构2) 超二级结构3) 结构域4) 三级结构5) 四级结构3. 一级结构决定高级结构，高级结构决定功能1.4 蛋白质的分子结构举例说明蛋白质的结构层次1.4.2 蛋白质的一级结构 1 1、定义：、定义： 指蛋白质指蛋白质肽链肽

12、链中氨基酸中氨基酸的组成及排列顺序，它是实现蛋的组成及排列顺序，它是实现蛋白质空间结构及其功能的基础，白质空间结构及其功能的基础，又称为蛋白质的又称为蛋白质的化学结构化学结构、共价共价结构结构、初级结构初级结构2 2、蛋白质一级、蛋白质一级结构举例结构举例牛胰核糖核牛胰核糖核酸酶酸酶50年代末年代末Moore等等牛胰岛素牛胰岛素1953年年sanger等等肽及肽键 肽：肽：由一个氨基酸的由一个氨基酸的羧基和另一羧基和另一个氨基酸的个氨基酸的氨基脱水缩合而成的氨基脱水缩合而成的化化合物合物。 肽键肽键（酰胺键酰胺键） ：由一个氨基酸的由一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水

13、氨基脱水缩合而成的缩合而成的共价键共价键。 由两个氨基酸形成的肽叫由两个氨基酸形成的肽叫二肽二肽， 少于少于1010个氨基酸的肽叫个氨基酸的肽叫寡肽寡肽， 多于多于1010个氨基酸的肽叫个氨基酸的肽叫多肽多肽。 氨基酸脱水缩合形成肽氨基酸脱水缩合形成肽肽及肽键肽及肽键氨基酸残基氨基酸残基1.4.3 蛋白质的二级结构1、 定义：定义：指蛋白质多肽链主链的空间指蛋白质多肽链主链的空间走向（折叠和盘绕方式）走向（折叠和盘绕方式）2 2、四种二级结构单元、四种二级结构单元 -螺旋 -折叠 -转角 不规则卷曲-螺旋俯视图俯视图侧视图侧视图-螺旋的特征要点：螺旋的特征要点：有右手螺旋及左手螺旋两种，天然有

14、右手螺旋及左手螺旋两种，天然蛋白质中的蛋白质中的-螺旋几乎都是螺旋几乎都是右手螺旋右手螺旋，右手螺旋比左手的稳定右手螺旋比左手的稳定稳定性是靠稳定性是靠链内氢键链内氢键维持的，肽链维持的，肽链上上C=OC=O氧与它后面第氧与它后面第4 4个残基上的个残基上的N-HN-H氢氢之间形成氢键，氢键的取向几乎与中之间形成氢键，氢键的取向几乎与中心轴平行心轴平行每圈螺旋高度为每圈螺旋高度为0.540.54nmnm，含，含3.63.6个个氨基酸残基；每个氨基酸残基绕轴氨基酸残基；每个氨基酸残基绕轴旋转旋转100100，沿轴上升，沿轴上升0.150.15nmnm氨基酸残基的氨基酸残基的R R侧链在螺旋的外侧

15、，侧链在螺旋的外侧，其形状、大小及电荷等均影响其形状、大小及电荷等均影响-螺螺旋的形成旋的形成 -折叠定义：两条或多两条或多条几乎完条几乎完全伸展的全伸展的多肽链侧多肽链侧向聚集在向聚集在一起，靠一起，靠链间氢键链间氢键联结的片联结的片层结构层结构折叠的特征要点：折叠的特征要点：相邻肽链走向可相邻肽链走向可平行平行也可也可反平行反平行。肽链的肽链的N-N-端在同侧为平行式，不在同侧端在同侧为平行式，不在同侧为反平行式。从能量角度考虑反平行式为反平行式。从能量角度考虑反平行式更为稳定更为稳定 稳定性是靠稳定性是靠链间氢键链间氢键维持的，氢键是维持的，氢键是由相邻肽链主链上的由相邻肽链主链上的N-

16、HN-H和和C=OC=O之间形成之间形成的的氨基酸残基的氨基酸残基的R R侧链交替分布在片层侧链交替分布在片层的上下两侧的上下两侧 -转角( (- -回折、回折、- -弯曲、发夹弯曲、发夹结构结构 ) )定义：定义：是蛋白质分子中出现的是蛋白质分子中出现的180180回折。回折。-转角的特征要点转角的特征要点：主链骨架以主链骨架以180180返回折叠返回折叠由多肽链上由多肽链上4 4个连续的氨基酸残基组成，个连续的氨基酸残基组成，第第1 1个氨基酸残基的个氨基酸残基的C=OC=O与第与第4 4个氨基酸个氨基酸残基的残基的N-HN-H之间生成氢键之间生成氢键广泛存在于球状蛋白质中，多数由亲广泛存

17、在于球状蛋白质中，多数由亲水氨基酸残基组成水氨基酸残基组成 无规则卷曲无规则卷曲定义：定义：没有规律的多肽链主链骨架构没有规律的多肽链主链骨架构象象此结构看来杂乱无章，但对一种特定此结构看来杂乱无章，但对一种特定蛋白又是确定的，而不是随意的。蛋白又是确定的，而不是随意的。酶的活性中心往往在无规则卷曲中。酶的活性中心往往在无规则卷曲中。 1.4.4 超二级结构：超二级结构：若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则，在空间上能辨认的二级结构组合体。1.4.5 结构域：结构域：多肽链上由相邻的超多肽链上由相邻的超二级结构单元联系而成的局部性区域二级结构单元联系而成的局部性区域，多肽

18、链，多肽链折叠成近乎球状的高级结构。折叠成近乎球状的高级结构。补充：补充：1.4 .6 蛋白质的三级结构定义：建立在二级结构、超二级结构建立在二级结构、超二级结构乃至结构域的基础上，乃至结构域的基础上，一条多肽链一条多肽链中中所有氨基酸残基的空间关系所有氨基酸残基的空间关系（构（构象）象）。 举例：举例：肌红蛋白肌红蛋白肌红蛋白肌红蛋白1 1条多肽条多肽链链1 1个血红素辅基个血红素辅基结构域三级结构对于小分子蛋白质来说，结构域就是对于小分子蛋白质来说，结构域就是其三级结构；其三级结构；大分子蛋白质则是由两个或两个以上大分子蛋白质则是由两个或两个以上相对独立的三维实体（结构域）缔合相对独立的三

19、维实体（结构域）缔合而成的。而成的。典型例子：典型例子：免疫球蛋白免疫球蛋白 木瓜蛋白酶内的2个结构域彼此很不相同弹性蛋白酶的二个结构域彼此非常相似1.4.7 蛋白质的四级结构 1、定义：由两条或两条以上各自独立具有由两条或两条以上各自独立具有三级结构的多肽链三级结构的多肽链通过次级键通过次级键相互缔合而相互缔合而成的蛋白质结构成的蛋白质结构, ,四级结构只存在于四级结构只存在于具有两具有两条或以上肽链条或以上肽链组成的蛋白质中组成的蛋白质中。亚基（亚单位）：亚基（亚单位）：四级结构的蛋白质中每一个球四级结构的蛋白质中每一个球状蛋白。状蛋白。 单体蛋白质：单体蛋白质：只有一个亚基（三级结构）只

20、有一个亚基（三级结构） 寡聚蛋白质：寡聚蛋白质：由少量亚基组成的蛋白质，如由少量亚基组成的蛋白质，如四聚体血红蛋白四聚体血红蛋白 多聚蛋白质：多聚蛋白质：由大量亚基组成的蛋白质由大量亚基组成的蛋白质举例：血红蛋白1.4.8 维系蛋白质分子结构维系蛋白质分子结构的作用力的作用力u共价键：共价键：肽肽键、二硫键键、二硫键u非共价键：非共价键：氢键、离子键、氢键、离子键、疏水键、范德华疏水键、范德华力力二硫键二硫键(二硫桥二硫桥)是由两个半胱氨酸侧是由两个半胱氨酸侧链的巯基链的巯基SH脱氢脱氢而形成的。而形成的。二硫键用于稳定蛋白二硫键用于稳定蛋白质的三、四级高级构质的三、四级高级构象。象。氢键氢键

21、多肽链中侧链间或侧链多肽链中侧链间或侧链与主链骨架间所生成的氢与主链骨架间所生成的氢键是维持蛋白质三、四级键是维持蛋白质三、四级结构所需的结构所需的多肽链中主链骨架中的氢键是维多肽链中主链骨架中的氢键是维持蛋白质二级结构主要的次级键持蛋白质二级结构主要的次级键疏水键疏水键(疏水作用力疏水作用力)蛋白质中的疏水氨基酸残基避开蛋白质中的疏水氨基酸残基避开水分子而聚集在分子内部的趋向力。水分子而聚集在分子内部的趋向力。它是维持蛋白质分子三、四级结它是维持蛋白质分子三、四级结构最主要的作用力。构最主要的作用力。离子键离子键(盐键盐键)正、负电荷的侧链基团之间的一正、负电荷的侧链基团之间的一种静电吸引作

22、用。种静电吸引作用。范德华力范德华力中性分子或中性原子之间弱的作用力，中性分子或中性原子之间弱的作用力，参与维持蛋白质分子三、四级结构参与维持蛋白质分子三、四级结构1.5 蛋白质的性质两性性质及等电点两性性质及等电点胶体性质胶体性质沉淀作用沉淀作用颜色反应颜色反应变性作用变性作用紫外吸收性质紫外吸收性质1.5.1 蛋白质的两性性质及等电点 蛋白质的蛋白质的等电点：等电点：蛋白质所带蛋白质所带净电荷净电荷为零时，所处溶液的为零时，所处溶液的pHpH 值即为该蛋白质值即为该蛋白质的等电点的等电点。等电点与等离子点等电点与等离子点 中性盐的存在常导致蛋白质的等电点发中性盐的存在常导致蛋白质的等电点发

23、生明显的改变生明显的改变 实际测得的等电点与介质的离子组成有实际测得的等电点与介质的离子组成有关关 在在不含任何盐的纯水不含任何盐的纯水中测得的等电点称中测得的等电点称为为蛋白质的等离子点蛋白质的等离子点，是蛋白质的特征，是蛋白质的特征常数常数1.5.2蛋白质的胶体性质 蛋白质溶液具有胶体溶液的典蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如不能通过半透膜等。型性质，如不能通过半透膜等。 常用常用透析法透析法分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质稳定蛋白质胶体溶液的主要因素：稳定蛋白质胶体溶液的主要因素：蛋白质表面极性基团形成的蛋白质表面极性基团形成的水膜水膜( (水化层水化层) )将蛋白质颗粒彼此隔开，将蛋白质

24、颗粒彼此隔开，阻止其相互聚集而沉淀阻止其相互聚集而沉淀蛋白质颗粒在非等电状态下，带蛋白质颗粒在非等电状态下，带同种电荷同种电荷，互相排斥，不致聚集，互相排斥，不致聚集而沉淀而沉淀1.5.3蛋白质的沉淀作用p2761 1、定义：、定义： 蛋白质的水膜或电荷一旦除去，蛋白质的水膜或电荷一旦除去，蛋白质就会从溶液中沉淀下来蛋白质就会从溶液中沉淀下来2 2、分类：、分类：可逆沉淀可逆沉淀：在沉淀过程中，蛋白质的结构：在沉淀过程中，蛋白质的结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液。，可以重新溶解形成溶液。不可逆沉淀不可逆沉淀：在沉淀过程中，蛋白质

25、的结：在沉淀过程中，蛋白质的结构和性质都发生了变化，沉淀不可能再重构和性质都发生了变化，沉淀不可能再重新溶解于水新溶解于水可逆沉淀蛋白质的常用方法： 盐析法盐析法( (中性盐沉淀法中性盐沉淀法) )盐析法盐析法( (中性盐沉淀法中性盐沉淀法) )：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐,使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。常用中性盐有(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。 盐溶：盐溶：向蛋白质水溶液中加入少量的中性盐，增加蛋白质表面的电荷，增强了蛋白质与水的作用，从而导致蛋白质在水中的溶解度增大 有机溶剂沉淀法：有机溶剂沉淀法：常用与水互溶的有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等，破坏水膜，使其沉淀。重金属盐

26、沉淀法重金属盐沉淀法常用重金属盐有常用重金属盐有HgHg2+2+盐、盐、PbPb2+2+盐、盐、CuCu2+2+盐等盐等生物碱试剂沉淀法生物碱试剂沉淀法常用生物碱试剂如单宁酸、苦味酸、常用生物碱试剂如单宁酸、苦味酸、钨酸等钨酸等 不可逆沉淀蛋白质的常用方法：1.5.4蛋白质的颜色反应 反应反应 试剂试剂 颜色颜色 反应基团反应基团双缩脲反应双缩脲反应 NaOH,稀稀CuSO4 紫红紫红 2个或个或2个以上肽键个以上肽键Folin酚试剂反应酚试剂反应 CuSO4磷钨酸磷钨酸-钼酸钼酸 兰色兰色 酚基酚基茚三酮反应茚三酮反应 茚三酮茚三酮 兰紫色兰紫色 游离氨基游离氨基 Millon反应反应 Mi

27、llon试剂试剂 红色红色 酚基酚基黄色反应黄色反应 HNO3及及NH3 黄、橘黄黄、橘黄 苯环苯环乙醛酸反应乙醛酸反应 乙醛酸，乙醛酸，H2SO4 紫红紫红 色氨酸吲哚基色氨酸吲哚基坂口反应坂口反应 次氯酸钠次氯酸钠,萘酚萘酚,NaOH 红色精氨酸的胍基红色精氨酸的胍基 双缩脲反应 蛋白质也有类似反应蛋白质也有类似反应红紫色络合物红紫色络合物(碱性溶液碱性溶液)Cu2+1.5.5蛋白质的变性与复性1 1、蛋白质的变性、蛋白质的变性1 1、蛋白质的变性：、蛋白质的变性：天然蛋白质因受物理、化学因素的天然蛋白质因受物理、化学因素的影响，次级键及影响，次级键及( (或或) )二硫键断裂，二硫键断裂

28、，引起天然构象的改变，从而导致生引起天然构象的改变，从而导致生物活性的丧失以及一些理化性质的物活性的丧失以及一些理化性质的改变，但不破坏蛋白质一级结构的改变，但不破坏蛋白质一级结构的现象。现象。实质蛋白质的复性：蛋白质的复性：当变性因素除去后，当变性因素除去后，某些某些变性蛋白质又可恢复到天然构变性蛋白质又可恢复到天然构象的现象象的现象2 2、变性蛋白质特性变性蛋白质特性失去结晶能力失去结晶能力及及生物活性的丧失生物活性的丧失是蛋是蛋白质变性的主要特征。白质变性的主要特征。理化性质改变：理化性质改变：溶解度显著降低溶解度显著降低，粘，粘度增加，分子伸展，分子不称性增加度增加，分子伸展，分子不称

29、性增加等。等。生物化学性质改变：分子结构伸展松生物化学性质改变：分子结构伸展松散，一些侧链基团外露，可发生反应散，一些侧链基团外露，可发生反应的基团增加，易被蛋白酶水解。的基团增加，易被蛋白酶水解。沉淀的蛋白质不一定变性，如盐析沉淀的蛋白质不一定变性，如盐析作用作用变性的蛋白质也不一定沉淀，如牛变性的蛋白质也不一定沉淀，如牛奶加热沸腾奶加热沸腾思考：蛋白质变性与沉淀之间的关系1.5.6蛋白质的紫外吸收 大部分蛋白质均含有芳香族氨基酸。大部分蛋白质均含有芳香族氨基酸。 芳香族氨基酸对紫外光有吸收作用，芳香族氨基酸对紫外光有吸收作用，且在且在280280nm nm 附近有最大吸收。因此，附近有最大

30、吸收。因此，大多数蛋白质在大多数蛋白质在280280nm nm 附近显示强附近显示强的吸收。的吸收。 利用这个性质，可以对蛋白质进行利用这个性质，可以对蛋白质进行定性及定量测定。定性及定量测定。补充补充：1.6 蛋白质的分离纯化与鉴定 蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化 蛋白质的分析鉴定蛋白质的分析鉴定补充：补充：根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提抽提。水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，酸性蛋白用稀碱水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。前处理：前处理：生物组织的机械破

31、碎生物组织的机械破碎动物材料动物材料：除结缔、脂肪组织：除结缔、脂肪组织- - 电动捣碎机、匀电动捣碎机、匀 浆器、超声波浆器、超声波植物组织植物组织：去种皮：去种皮- - 石英砂、玻璃粉石英砂、玻璃粉细菌细胞细菌细胞：超声波震荡、砂研磨、高压、溶菌酶：超声波震荡、砂研磨、高压、溶菌酶1.6.1 蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化粗分离粗分离(沉淀法沉淀法)细分细分离离(电泳法电泳法、层析法层析法、离心法离心法)结晶结晶1 1、沉淀法：、沉淀法：盐析沉淀法盐析沉淀法等电点沉淀法等电点沉淀法低温有机溶剂沉淀法低温有机溶剂沉淀法2 2、透透析析法法超滤法超滤法3、超超滤滤法法原理：原理：利用具有一定

32、大小孔径的利用具有一定大小孔径的微孔滤微孔滤膜膜，对生物大分子溶液进行过滤，对生物大分子溶液进行过滤，使大分子保留在超滤膜上面的溶液使大分子保留在超滤膜上面的溶液中，小分子物质及水过滤出去，从中，小分子物质及水过滤出去，从而达到脱盐或浓缩的目的。而达到脱盐或浓缩的目的。 4、电泳法电泳法 电泳：带电颗粒在电场中向电荷相反的电泳：带电颗粒在电场中向电荷相反的电极移动的现象电极移动的现象 不同的蛋白质颗粒的大小、形状、所带不同的蛋白质颗粒的大小、形状、所带的电荷、等不同，在电场中的泳动速度的电荷、等不同，在电场中的泳动速度各异，因而可聚集形成不同的条带，从各异，因而可聚集形成不同的条带，从而达到分

33、离的目的。而达到分离的目的。 5 5、 层析法：层析法：离子交换层析法离子交换层析法凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法亲和层析法亲和层析法吸附层析法吸附层析法分配层析法分配层析法离子交换层析法离子交换层析法原理原理: :根据根据离子交换剂离子交换剂与蛋白质进行离子与蛋白质进行离子交换，再利用适当的缓冲液洗脱，即交换，再利用适当的缓冲液洗脱，即可达到分离具有不同电荷性质蛋白质可达到分离具有不同电荷性质蛋白质的目的。的目的。凝胶过凝胶过滤层析法滤层析法(排阻层析，排阻层析，分子筛层分子筛层析析)原理：原理： 混合物流混合物流经装有凝胶颗粒（经装有凝胶颗粒（凝胶颗凝胶颗粒内部具有大量一定大小的微孔粒内部具

34、有大量一定大小的微孔）的层）的层析柱时，大分子不能进入凝胶孔内，移析柱时，大分子不能进入凝胶孔内，移动较快，并最先被洗脱出来；小分子能动较快，并最先被洗脱出来；小分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长，移动速度较慢，最内经过的路程较长，移动速度较慢，最后被洗脱出来。后被洗脱出来。亲合层析法亲合层析法亲和蛋白亲和蛋白配基配基原理：原理：利用某种蛋白质能与其相应的专利用某种蛋白质能与其相应的专一性配基进行特异的可逆结合的一性配基进行特异的可逆结合的能力能力（亲合力）来纯化生物大分子。（亲合力）来纯化生物大分子。6、密度梯度、密度梯度(区区带带)离

35、心法离心法原理：原理：在密度梯度介质（蔗糖或甘油）在密度梯度介质（蔗糖或甘油）中进行的一种沉降速度离心。混合物中进行的一种沉降速度离心。混合物加至制备好的密度梯度介质中，超速加至制备好的密度梯度介质中，超速离心，各种蛋白质颗粒沉降到与自身离心，各种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度时，即停止不前，密度相等的介质梯度时，即停止不前，最终形成各自独立的区带。最终形成各自独立的区带。1.6.2 1.6.2 蛋白质的分析鉴定蛋白质的分析鉴定蛋白质分子量的测定蛋白质分子量的测定蛋白质的含量测定蛋白质的含量测定1、蛋白质分子量的测定十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠- -聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶电泳法胺凝胶电泳法（SDSSDSPAGEPAGE法）法）SDS：阴离子表面活性剂，消除电荷因阴离子表面活性剂，消除电荷因素素SDS-蛋白质复合物：全呈长椭圆棒状，蛋白质复合物：全呈长椭圆棒状，消除形状因素。消除形状因素。迁移率只取决于蛋白质分子量的大小迁移率只取决于蛋白质分子量的大小相对迁移率相对迁移率Rm=样品移动的距离样品移动的距离/指指示染料移动的距离示染料移动的距离2、蛋白质含量的测定 微量凯氏定氮法微量凯氏定氮法 双缩脲法双缩脲法 FolinFolin- -酚法酚法( (LowryLowry法法)