基因工程的下游技术重组蛋白的表达,纯化和分析

1、基因工程的下游技术基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析重组蛋白的表达、纯化和分析 重组蛋白的表达重组蛋白的表达表达体系：表达体系： 表达载体表达载体 原核原核 受体细胞受体细胞 真核真核选择表达载体常用的关键元件：选择表达载体常用的关键元件：启动子和调节序列（表达强弱、细胞或组织特启动子和调节序列（表达强弱、细胞或组织特异性、表达调节等，如本实验的乳糖操纵子。）异性、表达调节等，如本实验的乳糖操纵子。）融合基因（纯化、标签，或增强蛋白可溶性等。融合基因（纯化、标签，或增强蛋白可溶性等。如多聚如多聚His标签标签6His，便于镍柱亲和层析纯，便于镍柱亲和层析纯化。化。GST融合蛋白用融

2、合蛋白用GST柱亲和层析）柱亲和层析）分泌信号分泌信号筛选标记筛选标记其它其它6His 重组蛋白的纯化重组蛋白的纯化亲和层析亲和层析离子交换层析离子交换层析凝胶过滤层析凝胶过滤层析 本单元实验流程：本单元实验流程：细菌（细菌（pEF-GFPuv） 亲和层析亲和层析IPTG诱导诱导细菌总蛋白细菌总蛋白重组蛋白融合蛋白重组蛋白融合蛋白乳糖操纵子的特性乳糖操纵子的特性SDS-PAGE初步分析初步分析一一实验目的实验目的二二实验原理实验原理三三材料与试剂材料与试剂四四实验仪器实验仪器五五操作步骤操作步骤六六注意事项注意事项七七实验安排实验安排八八思考与讨论思考与讨论一一实验目的实验目的了解和掌握了解和

3、掌握IPTG诱导表达的原理。诱导表达的原理。了解降解物阻遏的现象及其机理。了解降解物阻遏的现象及其机理。二二实验原理实验原理操纵子是基因表达的协调单位。通常由操纵子是基因表达的协调单位。通常由2个以上功能相关的结构基因以及一些调节个以上功能相关的结构基因以及一些调节序列（如启动子序列、操纵序列等）组成。序列（如启动子序列、操纵序列等）组成。乳糖操纵子由三个结构基因乳糖操纵子由三个结构基因Z、Y、A和和操纵序列、启动子、操纵序列、启动子、CAP结合位点等调结合位点等调节序列组成。节序列组成。 乳糖操纵子的诱导表达乳糖操纵子的诱导表达l当没有乳糖存在时，调节基因当没有乳糖存在时，调节基因lacI表

4、达，转录表达，转录的的mRNA翻译成阻遏蛋白。阻遏蛋白与操纵翻译成阻遏蛋白。阻遏蛋白与操纵序列序列lacO结合，阻碍了结合在旁边启动子的结合，阻碍了结合在旁边启动子的RNA聚合酶向前移动，使结构基因不能转录，聚合酶向前移动，使结构基因不能转录，也就不能翻译出蛋白质。也就是说，当没有也就不能翻译出蛋白质。也就是说，当没有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻碍状态。乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻碍状态。 乳糖操纵子的诱导表达（续）乳糖操纵子的诱导表达（续）l当有乳糖存在时，乳糖转化为异乳糖，异乳当有乳糖存在时，乳糖转化为异乳糖，异乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白

5、的构象发生改变，而不能结合到操纵序列上，的构象发生改变，而不能结合到操纵序列上，RNA聚合酶可以从启动子向聚合酶可以从启动子向3端移动，于是，端移动，于是，结构基因可以转录出结构基因可以转录出mRNA，然后翻译出蛋，然后翻译出蛋白质。也就是说，当有乳糖存在时，乳糖操白质。也就是说，当有乳糖存在时，乳糖操纵子被诱导。纵子被诱导。l 乳糖操纵子的诱导物是异乳糖。乳糖操纵子的诱导物是异乳糖。IPTG是异是异乳糖的结构类似物。由于乳糖的结构类似物。由于IPTG不会被分解，不会被分解，它的诱导作用是持久的。它的诱导作用是持久的。 乳糖操纵子的诱导表达（续）乳糖操纵子的诱导表达（续）l本实验所使用的表达载

6、体上含有乳糖操纵子本实验所使用的表达载体上含有乳糖操纵子的调节序列，目的基因为绿色荧光蛋白基因。的调节序列，目的基因为绿色荧光蛋白基因。在在IPTG的诱导下，目的基因表达可增强的诱导下，目的基因表达可增强105倍。然而，诱导表达常常受到温度和诱导物倍。然而，诱导表达常常受到温度和诱导物的影响。的影响。乳糖操纵子的降解物乳糖操纵子的降解物阻遏阻遏l当细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基中生长当细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基中生长时，通常优先利用葡萄糖，而不利用乳糖。时，通常优先利用葡萄糖，而不利用乳糖。只有当葡萄糖耗尽后，细菌才能充分利用乳只有当葡萄糖耗尽后，细菌才能充分利用乳糖，这种现象称葡萄糖效应

7、，其实质是由葡糖，这种现象称葡萄糖效应，其实质是由葡萄糖降解物引起的阻遏作用，所以又称降解萄糖降解物引起的阻遏作用，所以又称降解物阻遏（物阻遏（catabolic repression）。）。乳糖操纵子的降解物乳糖操纵子的降解物阻遏（续）阻遏（续）l降解物降解物阻遏的机理：代谢物基因激活蛋白阻遏的机理：代谢物基因激活蛋白（Catabolite gene Activation Protein，CAP），又称），又称cAMP受体蛋白（受体蛋白（cAMP Receptor Protein，CRP）属于激活蛋白的一）属于激活蛋白的一种，对乳糖操纵子进行正调节。种，对乳糖操纵子进行正调节。 CAP分子内

8、分别有分子内分别有DNA结合区和结合区和cAMP结合结合区。当区。当CAP与与cAMP结合后，就可结合到结合后，就可结合到CAP结合位点上，促进转录。结合位点上，促进转录。 葡萄糖降解物能抑制腺苷酸环化酶的活性，葡萄糖降解物能抑制腺苷酸环化酶的活性，并活化磷酸二酯酶的活性，从而降低并活化磷酸二酯酶的活性，从而降低cAMP的浓度，抑制转录。的浓度，抑制转录。 阻遏蛋白负调节与阻遏蛋白负调节与CAP正调节的协调正调节的协调 当阻遏蛋白封闭转录时，当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能对该系统不能发挥作用；而没有发挥作用；而没有CAP存在时，即使没有阻存在时，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子

9、仍无转录活遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。只有在性。只有在CAP存在且没有阻遏蛋白与操纵存在且没有阻遏蛋白与操纵序列结合时，或者说只有高乳糖低葡萄糖时，序列结合时，或者说只有高乳糖低葡萄糖时，操纵子发挥最大转录活性。操纵子发挥最大转录活性。 这种协调与细菌对碳源的优先利用相一致。这种协调与细菌对碳源的优先利用相一致。The structure of lac operon调节序列调节序列结构基因结构基因Repressor and negative regulation异乳糖异乳糖异丙基硫代半乳糖苷异丙基硫代半乳糖苷异乳糖异乳糖CAP and positive regulation 低乳

10、糖时低乳糖时 高乳糖时高乳糖时在协调调节下，在协调调节下，lac operon的强诱导作用发生在高乳的强诱导作用发生在高乳糖、低葡萄糖的状态。糖、低葡萄糖的状态。三三材料与试剂材料与试剂1.材料材料 含含pUC18质粒工程菌及含质粒工程菌及含pGFPuv质粒工质粒工程菌。程菌。2.试剂试剂LB 液体培养基液体培养基 ： 蛋白胨（蛋白胨（tryptone）10g、酵母粉（酵母粉（yeast extract）5g、NaCl 10g，加，加800mL双蒸双蒸水溶解，用水溶解，用10M NaOH调调pH至至7.2-7.5，定容至定容至1000mL。 分装，高压灭菌，分装，高压灭菌，4保存。保存。 氨苄

11、青霉素溶液：氨苄青霉素溶液： 无菌双蒸水配成无菌双蒸水配成100mg/mL，分装，分装，-20保保存，使用终浓度为存，使用终浓度为50g/mL或或100g/mL。 IPTG溶液：溶液： 将将238.3mg IPTG溶解于溶解于10mL双蒸水，双蒸水，0.22m细菌滤器过滤除菌，分装，细菌滤器过滤除菌，分装，-20保保存备用，贮存浓度为存备用，贮存浓度为100 mM。 20%葡萄糖溶液：葡萄糖溶液： 20g葡萄糖溶解于适量双蒸水，定容至葡萄糖溶解于适量双蒸水，定容至100mL，121，15min 灭菌，灭菌，4保存。保存。四四实验仪器实验仪器 超净工作台、超净工作台、 恒温摇床、离心机等。恒温摇

12、床、离心机等。五五操作步骤操作步骤1.挑取含挑取含pUC18质粒工程菌及含质粒工程菌及含pGFPuv质质粒工程菌单菌落，分别接种于含氨苄青霉粒工程菌单菌落，分别接种于含氨苄青霉（终浓度为（终浓度为100g/mL，以下同以下同)的的5mL的的LB培养基中，于培养基中，于37、250rpm过夜培养过夜培养12h-14h至对数生长期。至对数生长期。2.取取3支已灭菌的大试管，分别加入支已灭菌的大试管，分别加入5mL含含有氨苄青霉素的有氨苄青霉素的LB培养液，编号为培养液，编号为1#，2#，3#，另取一个，另取一个250mL的灭菌三角瓶，的灭菌三角瓶，编号为编号为6#，加入，加入50mL含氨苄青霉素的

13、含氨苄青霉素的LB培养液。培养液。3. 1#：接：接50L空载工程菌（含空载工程菌（含pUC18）过夜培过夜培养物，养物，25-28培养培养10 h-12h； 2#：接：接50L重组菌（含重组菌（含pGFPuv）过夜培养过夜培养物，物，25-28培养培养10 h-12h； 3#：接：接50L重组菌（含重组菌（含pGFPuv ）过夜培养过夜培养物，物，37培养至培养至O.D600约为约为0.5（约（约3h-4h)，然后加入然后加入20%葡萄糖葡萄糖50L至终浓度为至终浓度为0.2%，及及100mM IPTG 5L至终浓度为至终浓度为0.1mM，25-28培养培养8h-10h或过夜；或过夜； 6#

14、：接：接500L重组菌（含重组菌（含pGFPuv）过夜培养过夜培养物，物，37培养至培养至O.D600约为约为0.5（约（约3h-4h)，然后只加入然后只加入100mM IPTG 50L至终浓度为至终浓度为0.1 mM，25-28培养培养8h-10h或过夜或过夜。4. 收集菌体。分别将收集菌体。分别将1#-3#全部培养物收集到全部培养物收集到三个三个7mL离心管中，编上相应编号，离心弃上离心管中，编上相应编号，离心弃上清；三角瓶培养的清；三角瓶培养的50mL菌液混匀后取菌液混匀后取5mL于于7mL离心管中（编号为离心管中（编号为4#），离心，上清收集），离心，上清收集到另一个指管，编号为到另一

15、个指管，编号为5#，其余的培养液用，其余的培养液用 50mL离心管于离心管于5000rpm，4，离心，离心10min，弃上清，菌体用裂解缓冲液重悬后用超声波破弃上清，菌体用裂解缓冲液重悬后用超声波破碎细胞或保存于碎细胞或保存于20备用（见实验十二）。备用（见实验十二）。 5. 于紫外灯下观察于紫外灯下观察1# -5#管收集的菌体或上清管收集的菌体或上清液，观察哪支管有荧光，记录观察到的现象。液，观察哪支管有荧光，记录观察到的现象。注意：把注意：把1#和和2#管置管置4保存。分别标保存。分别标Sample1和和Sample2。 1236pUC18pGFPuv挑取单菌落，接种于挑取单菌落，接种于5

16、mLLBA培养基中。培养基中。37过夜培养。过夜培养。按按1:100接种接种对照对照IPTG+GlcIPTG12361234525 -28培养过夜培养过夜5000rpm离离心心，收菌体收菌体取取5mL离心离心其余离心收其余离心收菌体，提取菌体，提取蛋白蛋白六六注意事项注意事项1.本实验的目的是比较该重组本实验的目的是比较该重组DNA在大肠在大肠杆菌中表达时受杆菌中表达时受IPTG和葡萄糖存在的影和葡萄糖存在的影响。在转管培养及收菌时要注意各管编响。在转管培养及收菌时要注意各管编号要相应对好，不能混乱。号要相应对好，不能混乱。 1#、2#管不加管不加IPTG和葡萄糖。和葡萄糖。3#管除加管除加I

17、PTG外还加入葡萄糖（浓度要大于外还加入葡萄糖（浓度要大于0.2%以上）。以上）。 6#瓶仅加瓶仅加IPTG 。2. 不同的重组不同的重组DNA在不同的宿主菌中蛋白的在不同的宿主菌中蛋白的表达量往往受到表达量往往受到IPTG浓度和培养温度的影浓度和培养温度的影响。在科研中一般都采用不同温度或不同响。在科研中一般都采用不同温度或不同浓度的浓度的IPTG来诱导，以获得最大的蛋白表来诱导，以获得最大的蛋白表达量。达量。3. 本实验所表达的绿色荧光蛋白基因，其产本实验所表达的绿色荧光蛋白基因，其产物在大肠杆菌中有很强的荧光。离心后收物在大肠杆菌中有很强的荧光。离心后收集的菌体在紫外线的照射下可见黄绿色

18、荧集的菌体在紫外线的照射下可见黄绿色荧光，所以把光，所以把1#、2#、3#、4#沉淀菌体放在沉淀菌体放在紫外灯下观察其是否有荧光以及荧光的强紫外灯下观察其是否有荧光以及荧光的强弱，就可判断其是否有表达及其所表达的弱，就可判断其是否有表达及其所表达的强度。强度。七七实验安排实验安排 第一天：第一天： 上午配试剂，灭菌；上午配试剂，灭菌； 下午开始接种，约下午开始接种，约3 h-4h后开始诱导。后开始诱导。（步骤（步骤2、3） 第二天：第二天： 收菌、紫外观察结果和拍照；收菌、紫外观察结果和拍照； 破碎细菌，分离上清，待过柱。破碎细菌，分离上清，待过柱。八八思考与讨论思考与讨论1.对紫外灯下观察到

19、的结果作出解释。对紫外灯下观察到的结果作出解释。2.为什么诱导表达的大肠杆菌要在其为什么诱导表达的大肠杆菌要在其OD600浓度约为浓度约为0.5时加入时加入IPTG？3.大肠杆菌的诱导表达常受哪些因素的影大肠杆菌的诱导表达常受哪些因素的影响？响？一一实验目的实验目的二二实验原理实验原理三三材料与试剂材料与试剂四四实验仪器实验仪器五五操作步骤操作步骤六六注意事项注意事项七七实验安排实验安排八八思考与讨论思考与讨论一实验目的一实验目的 学习亲和层析的原理。学习亲和层析的原理。 掌握亲和层析法分离蛋白质的技术与掌握亲和层析法分离蛋白质的技术与操作。操作。二二实验原理实验原理 以普通凝胶作载体，连接上

20、金属离子制成螯以普通凝胶作载体，连接上金属离子制成螯合吸附剂，用于分离纯化蛋白质，这种方法合吸附剂，用于分离纯化蛋白质，这种方法称为金属螯合亲和层析。称为金属螯合亲和层析。 蛋白质对金属离子具有亲和力是这种方法的蛋白质对金属离子具有亲和力是这种方法的理论依据。已知蛋白质中的组氨酸和半胱氨理论依据。已知蛋白质中的组氨酸和半胱氨酸残基在接近中性的水溶液中能与镍或铜离酸残基在接近中性的水溶液中能与镍或铜离子形成比较稳定的络合物，因此，连接上镍子形成比较稳定的络合物，因此，连接上镍或铜离子的载体凝胶可以选择性地吸附含咪或铜离子的载体凝胶可以选择性地吸附含咪唑基和巯基的肽和蛋白质。唑基和巯基的肽和蛋白质

21、。 过渡金属元素镍在较低过渡金属元素镍在较低pH范围时（范围时（pH 6-8），），有利于选择性地吸附带咪唑基和巯基有利于选择性地吸附带咪唑基和巯基的肽和蛋白质。在碱性的肽和蛋白质。在碱性pH时吸附更有效，时吸附更有效，但选择性降低。但选择性降低。 金属螯合亲和层析在很大程度上，由被吸金属螯合亲和层析在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白质分子表面咪唑基和巯基的附的肽和蛋白质分子表面咪唑基和巯基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。 用用IPTG诱导表达的蛋白质含有特定的组氨诱导表达的蛋白质含有特定的组氨酸标签，这种可溶性蛋白质能用金属亲和酸标签，这种可溶性蛋白质

22、能用金属亲和层析法进行分离，且操作简单，快速，纯层析法进行分离，且操作简单，快速，纯化效率高。化效率高。三三材料与试剂材料与试剂1.材料材料 含含pUC18质粒工程菌及含重组质粒工程菌及含重组pGFPuv质粒质粒工程菌经诱导表达的细胞裂解蛋白。工程菌经诱导表达的细胞裂解蛋白。2.试剂试剂0.05mol/L EDTA-0.5mol/L NaCl溶液溶液 50mL2mol/L NaCl 溶液溶液 50mL1mol/L NaOH溶液溶液 50mL0.2mol/L NiSO4溶液溶液 30mL 起始缓冲液：起始缓冲液：50mmol/L Tris-HCl; 500mmol/L NaCl; pH7.0 5

23、00mL Chelating Sepharose Fast Flow 4-5 mL 大肠杆菌细胞裂解蛋白样品大肠杆菌细胞裂解蛋白样品 10-20mL 洗涤液：洗涤液：50mmol/L咪唑；咪唑；50mmol/L Tris-HCl； 0.5mol/L NaCl，pH 7.0 洗脱液：洗脱液：300mmol/L咪唑；咪唑；50mmol/L Tris-HCl；0.5mol/L NaCl，pH7.0 四四实验仪器实验仪器 1.5cm X 50cm层析柱、自动分部收集层析柱、自动分部收集器、紫外分光光度计、紫外检测仪及器、紫外分光光度计、紫外检测仪及记录仪等。记录仪等。五五操作步骤操作步骤1.样品的制备

24、样品的制备: 细胞的培养及荧光蛋白表达见实验十，细胞的培养及荧光蛋白表达见实验十，细胞的破碎及蛋白的收集如下：细胞的破碎及蛋白的收集如下： 收集在收集在25培养的细胞培养液，培养的细胞培养液，5000r/min，离心离心10min，去上清液，菌体用起始缓冲液去上清液，菌体用起始缓冲液洗涤一次，离心收集菌体，用三分之一洗涤一次，离心收集菌体，用三分之一（细胞培养液）体积（细胞培养液）体积（15mL）的起始缓冲）的起始缓冲液充分悬浮，冰浴下进行超声波处理，功液充分悬浮，冰浴下进行超声波处理，功率为率为400W，工作工作4秒，间隙秒，间隙4 秒，为一次，秒，为一次，99次为一周期。共处理六周期。然后

25、次为一周期。共处理六周期。然后8000r/min,离心离心30min，取上清液。放冰箱取上清液。放冰箱备用。备用。2. 亲和层析柱的安装亲和层析柱的安装 把层析柱固定在铁支架上，柱下端出把层析柱固定在铁支架上，柱下端出口封闭。加入少量的无离子水，排去下端口封闭。加入少量的无离子水，排去下端的空气泡。取出的空气泡。取出20%乙醇浸泡的螯合凝胶乙醇浸泡的螯合凝胶4mL到烧杯中，加入少量的无离子水制成到烧杯中，加入少量的无离子水制成糊状，沿着贴紧柱内壁的玻璃棒把糊状凝糊状，沿着贴紧柱内壁的玻璃棒把糊状凝胶倒进柱内，打开下端的排水口，让亲和胶倒进柱内，打开下端的排水口，让亲和凝胶剂随水流自然沉下。亲和

26、层析剂为凝胶剂随水流自然沉下。亲和层析剂为4-5mL。3. 亲和凝胶的再生处理：亲和凝胶的再生处理： 用用10 倍柱体积的再生溶液（倍柱体积的再生溶液（0.05mol/L EDTA、 0.5mol/L NaCl）过柱，流速过柱，流速3mL/min。1drops/2s! 用用5倍柱体积的倍柱体积的2 mol/L NaCl 溶液洗亲和层析柱除溶液洗亲和层析柱除去多余的去多余的EDTA。流速。流速3mL/min。 用用5倍柱体积的倍柱体积的1 mol/L NaOH溶液洗涤层析柱，流溶液洗涤层析柱，流速速2mL/min。 用用10倍柱体积的无离子水洗至倍柱体积的无离子水洗至pH8-9，流速流速3mL/

27、min。 用用2倍柱体积的倍柱体积的0.2mol/L的硫酸镍溶液过层析柱，使的硫酸镍溶液过层析柱，使凝胶金属镍离子结合凝胶金属镍离子结合, 流速流速2mL/min。过完后放置。过完后放置5 分钟。分钟。 用用10倍柱体积的无离子水洗涤层析柱除去多余的镍倍柱体积的无离子水洗涤层析柱除去多余的镍离子。流速离子。流速3mL/min。 用用5 倍柱体积的起始缓冲溶液平衡层析柱，备用。倍柱体积的起始缓冲溶液平衡层析柱，备用。4. 上样：上样： 先从先从15mL裂解上清液中取出裂解上清液中取出50L准备用于准备用于电泳，作为亲和层析分离前上清液中的总蛋区电泳，作为亲和层析分离前上清液中的总蛋区带对照图谱（

28、带对照图谱（Sample3）。然后以每分钟）。然后以每分钟1mL的的流速上层析柱，分部收集流出液，每管流速上层析柱，分部收集流出液，每管3mL，（测得的（测得的OD280值曲线为穿流峰，取最高的一管值曲线为穿流峰，取最高的一管样品液用作电泳，标样品液用作电泳，标Sample4）。再用）。再用10mL起起始缓冲液过层析柱，操作同前。始缓冲液过层析柱，操作同前。5. 洗涤：洗涤： 用含用含50 mmol/L咪唑的洗涤缓冲液咪唑的洗涤缓冲液25mL洗脱洗脱，分部收集洗脱液，每管，分部收集洗脱液，每管5mL，取中间管样品取中间管样品电泳（电泳（Sample5） 。6. 洗脱：洗脱： 用含用含300mm

29、ol/L咪唑的洗脱缓冲液咪唑的洗脱缓冲液10mL洗脱洗脱，用，用Ep管分部收集洗脱液。每管收管分部收集洗脱液。每管收0.5mL。（。（测得的测得的OD280值曲线峰为目的蛋白峰值曲线峰为目的蛋白峰GFP，标，标Sample6 ）。）。7. 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：进行进行12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测亲和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测亲和层析分离纯化的结果。层析分离纯化的结果。Sample1-6，外加，外加Marker（见实验十一）。（见实验十一）。 六六注意事项注意事项1. 不管是装柱还是上样、洗脱，在整个操作过不管是装柱还是上样、洗脱，在整个操作过程

30、中，水或溶液面都不能低于凝胶柱平面。程中，水或溶液面都不能低于凝胶柱平面。否则，凝胶柱会产生气泡，就会影响层析效否则，凝胶柱会产生气泡，就会影响层析效果。果。2. 样样品上柱和洗脱过程，其流速都要慢，分离品上柱和洗脱过程，其流速都要慢，分离效果才好。效果才好。3. 亲和层析剂可回收，经再生可循环使用。该亲和层析剂可回收，经再生可循环使用。该亲和层析剂用亲和层析剂用20%20%乙醇浸泡于冰箱保存。乙醇浸泡于冰箱保存。4. 亲和层析柱在再生处理、上样、洗脱过程中亲和层析柱在再生处理、上样、洗脱过程中其颜色都有明显变化（白、蓝、绿），只要其颜色都有明显变化（白、蓝、绿），只要细心操作，样品是否被吸附

31、上去或被洗脱下细心操作，样品是否被吸附上去或被洗脱下来？都能观察到从而作出判断。来？都能观察到从而作出判断。七七实验安排实验安排 先用母液配制其它未配制溶液，再生先用母液配制其它未配制溶液，再生镍柱；然后，过柱纯化重组蛋白。镍柱；然后，过柱纯化重组蛋白。 八八思考与讨论思考与讨论1.解释解释IPTG诱导表达的荧光蛋白经诱导表达的荧光蛋白经12 SDS-PAGE电泳结果图谱。电泳结果图谱。2.镍柱在再生处理、上样、洗脱过程镍柱在再生处理、上样、洗脱过程中其颜色有何变化？为什么？中其颜色有何变化？为什么？3.要达到好的分离效果要注意哪些问要达到好的分离效果要注意哪些问题？题？一一实验目的实验目的二

32、二实验原理实验原理三三材料与试剂材料与试剂四四实验仪器实验仪器五五操作步骤操作步骤六六注意事项注意事项七七实验安排实验安排八八思考与讨论思考与讨论一一.实验目的实验目的 1. 了解了解SDS-PAGE灵敏度高，分辩率强的灵敏度高，分辩率强的原理。原理。2. 用此法分析不同条件下培养的菌其荧光用此法分析不同条件下培养的菌其荧光蛋白表达情况。蛋白表达情况。 二二实验原理实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide,简称简称

33、ACR）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（和交联剂甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylsmide 简称简称BIS）在催化在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构的剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶，通过改变单体浓度与交联剂的比例可凝胶，通过改变单体浓度与交联剂的比例可以得到不同孔径的凝胶。以得到不同孔径的凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：（1）化学聚合：催化剂采用过硫酸铵，加）化学聚合：催化剂采用过硫酸铵，加速剂为速剂为N、N、N、N四甲基乙二胺（简四甲基乙二胺（简称称TEMED）。）。通常控制这两种溶液的用量通常控制这两种

34、溶液的用量使聚合在使聚合在1h内完成。（内完成。（2）光聚合：通常用）光聚合：通常用核黄素为催化剂，通过控制光照时间和强度核黄素为催化剂，通过控制光照时间和强度来控制聚合时间也可加速反应。本实验采用来控制聚合时间也可加速反应。本实验采用化学聚合。聚丙烯酰胺凝电泳常分为二大类：化学聚合。聚丙烯酰胺凝电泳常分为二大类：第一类为连续的凝胶（仅有分离胶）电泳；第一类为连续的凝胶（仅有分离胶）电泳；第二类为不连续的凝胶（浓缩胶和分离胶）第二类为不连续的凝胶（浓缩胶和分离胶）电泳。电泳。通常聚丙烯酰胺凝胶（不连续）电泳有三种通常聚丙烯酰胺凝胶（不连续）电泳有三种效应：电荷效应；（电泳物所带电荷的差效应：电

35、荷效应；（电泳物所带电荷的差异性）。异性）。 凝胶的分子筛效应。（凝胶的网凝胶的分子筛效应。（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致）浓状结构及电泳物的大小形状不同所致）浓缩效应，（凝胶浓度的不连续性、缓冲液离缩效应，（凝胶浓度的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、电位梯度的不连续性以子成分的不连续性、电位梯度的不连续性以及及pH的不连续性所致）。因此，样品分离效的不连续性所致）。因此，样品分离效果好，分辨率高。果好，分辨率高。SDS-PAGE，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）。十二烷基磺酸钠）。SDS破坏蛋白质的破坏蛋白质的二级和三级结构；

36、强还原剂使半胱氨酸之间二级和三级结构；强还原剂使半胱氨酸之间的二硫键断裂，因此，蛋白质在一定浓度的的二硫键断裂，因此，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的含有强还原剂的SDS溶液中，与溶液中，与SDS分子按比分子按比例结合，形成带负电荷的例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量的这种复合物由于结合大量的SDS，降低或消除，降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异。而了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异。而由于由于SDS与蛋白质的结合是按大小成比例的，与蛋白质的结合是按大小成比例的，在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决

37、于分子大小。当分子量在于分子大小。当分子量在15KD到到200KD之间之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：关系，符合下式：logMW=K-bX，式，式中：中：MW为分子量，为分子量，X为迁移率，为迁移率，k、b均为常数。均为常数。三三试剂试剂30%的凝胶贮备液的凝胶贮备液: Acr 29g + Bis 1g溶于溶于100mL去离子水中。避去离子水中。避光贮存棕色瓶中。光贮存棕色瓶中。3M Tris-HCl (pH8.9): 36.6g Tris-base + 48mL 1M HCl + dH2O至至100mL5Tris-甘氨酸电泳甘氨

38、酸电泳buffer（pH8.3): Tris-base15.1g + 甘氨酸甘氨酸94g + 5gSDS + H2O至至1L（用时稀释用时稀释5倍）。倍）。 10%SDS：10g SDS溶解于溶解于100mL去离子水去离子水中，贮存于室温中。中，贮存于室温中。0.5M Tris-HCl(pH6.8): 6.05g Tris-base + 48mL 1M HCl + dH2O至至100mLTEMED(四甲基乙二胺四甲基乙二胺):浓度浓度10%，20 mL (共用共用)10% AP(过硫酸铵过硫酸铵):10 mL，1g AP溶解于溶解于10mL去离子水中，新鲜配制。去离子水中，新鲜配制。 2x样品

39、缓冲液样品缓冲液： 100mM Tris-HCl(pH6.8) 200mM DTT(二硫苏糖醇二硫苏糖醇) 4% SDS 0.2% 溴酚蓝溴酚蓝 20% 甘油甘油 考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝染色液：0.25g考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250溶溶于于45mL甲醇中，加甲醇中，加10mL冰醋酸冰醋酸 + H2O至至100mL。（。（滤纸过滤除去不溶物）滤纸过滤除去不溶物） 脱色液：脱色液：75mL冰乙酸冰乙酸 + 50mL甲醇甲醇 + 875mL H2O（如只配（如只配500mL，各物质减半），各物质减半）四四实验仪器实验仪器 电泳仪、垂直板电泳装置、微量进电泳仪、垂直板电泳装置、微量进样器（样器（

40、5050LL）、染色、染色/ /脱色摇床等。脱色摇床等。五五操作步骤操作步骤1.胶板模型的安装：在干净的带隔板的玻璃板胶板模型的安装：在干净的带隔板的玻璃板的三条边上把橡胶条压上，然后将另一块凹的三条边上把橡胶条压上，然后将另一块凹形玻璃板压上，放入电泳槽中。（示范）形玻璃板压上，放入电泳槽中。（示范）2.12%分离胶的制备（每次配分离胶的制备（每次配10 mL） 去离子水去离子水 3.2mL 30% 凝胶液凝胶液 4.0mL 3mol/L Tris-HCl(pH8.9) 2.6mL 10% SDS 0.1mL 10% APS 0.1mL TEMED 0.005mL 用手轻摇约用手轻摇约2分钟

41、混匀分钟混匀(注意不要产生气注意不要产生气泡）泡）,小心将混合液注入准备好的玻璃板间隙小心将混合液注入准备好的玻璃板间隙中，为浓缩胶留足够的空间，轻轻在顶层加中，为浓缩胶留足够的空间，轻轻在顶层加入几毫升去离子水复盖，以阻止空气中氧对入几毫升去离子水复盖，以阻止空气中氧对凝合的抑制作用。刚加入水时可看出水与胶凝合的抑制作用。刚加入水时可看出水与胶液之间有界面，后渐渐消失，不久又出现界液之间有界面，后渐渐消失，不久又出现界面，这表明凝胶已聚合。再静置片刻使聚合面，这表明凝胶已聚合。再静置片刻使聚合完全。完全。 ！注意：为避免凝胶过快聚合，配胶用的无！注意：为避免凝胶过快聚合，配胶用的无离子水、离

42、子水、30%的凝胶液及的凝胶液及Tris-HCl缓冲液应缓冲液应事先于事先于4或冰上放置或冰上放置,以下同。以下同。3. 浓缩胶的制备：先吸去已聚合好的分离胶上浓缩胶的制备：先吸去已聚合好的分离胶上层的水，用水洗界面一次，再用滤纸吸干残层的水，用水洗界面一次，再用滤纸吸干残留的水液。按下列配方制备留的水液。按下列配方制备5毫升浓缩胶溶液。毫升浓缩胶溶液。混合后将其注入分离胶上端，插入梳子应小混合后将其注入分离胶上端，插入梳子应小心避免气泡。心避免气泡。 去离子水去离子水 3.2mL 30% 凝胶液凝胶液 0.83mL 0.5M Tris-HCl(pH6.8) 0.75mL 10% SDS 0.

43、050mL 10% AP 0.050mL TEMED 0.005mL4. 在浓缩胶聚合的同时，将样品与在浓缩胶聚合的同时，将样品与5样品缓冲样品缓冲液（液（16L 4L）混合，）混合，100加热加热3分钟以分钟以变性蛋白质。变性蛋白质。Sample1,2用用600L起始缓冲液起始缓冲液悬浮，取悬浮，取16L同上操作。同上操作。5. 浓缩胶聚合完全后，小心地拔出梳子，用无浓缩胶聚合完全后，小心地拔出梳子，用无离子水冲洗梳孔，将凝胶模板放入电泳槽上离子水冲洗梳孔，将凝胶模板放入电泳槽上固定好，上下槽均加入固定好，上下槽均加入1X电泳缓冲液，检查电泳缓冲液，检查有无漏液，除去两玻璃板间凝胶底部的气泡

44、，有无漏液，除去两玻璃板间凝胶底部的气泡，上样前用上槽缓冲液冲洗梳子孔。上样前用上槽缓冲液冲洗梳子孔。6. 按次序上样：用微量进样器往凝胶梳孔中加按次序上样：用微量进样器往凝胶梳孔中加样品混合液，样品混合液，20L/孔，一孔加一个样品，同孔，一孔加一个样品，同时安排已知分子量的标准物作对照。时安排已知分子量的标准物作对照。7. 电泳：开始时浓缩胶电压为电泳：开始时浓缩胶电压为80V，染料进入，染料进入分离胶后，将电压增到分离胶后，将电压增到120V，继续电泳至染，继续电泳至染料（溴酚蓝）到分离胶底部，断开电源。料（溴酚蓝）到分离胶底部，断开电源。8固定及染色：取下凝胶放入大培养皿，用考固定及染色：取下凝胶放入大培养皿，用考马斯蓝染色液