蛋白质的提取与分离纯化——生化实验设计讲解课件

1、主讲人：主讲人：第三组组员：第三组组员：华中师范大学化学学院华中师范大学化学学院l 已知某蛋白的分子量约为已知某蛋白的分子量约为17 kDa，等电点，等电点3.94.1，它能耐一定的高温，在，它能耐一定的高温，在90 C加热加热34 min后仍然能够保持后仍然能够保持80%的活性。该蛋白的活性。该蛋白含有较多的疏水性残基，与含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合后可以暴结合后可以暴露它的疏水基团。该蛋白的作用是作为生物体露它的疏水基团。该蛋白的作用是作为生物体内酶的激活剂。请设计一个从脑组织中提取和内酶的激活剂。请设计一个从脑组织中提取和分离纯化该蛋白的实验方案，要求写出具体的分离纯化该蛋白的实

2、验方案，要求写出具体的步骤和理由，以及检测方法。步骤和理由，以及检测方法。整个实验过程一般可分为整个实验过程一般可分为 5 个阶段：个阶段： 材料的选择和预处理材料的选择和预处理 细胞的破碎（有时细胞的破碎（有时需进行细胞器的分离）需进行细胞器的分离）提取提取 纯化（包括等纯化（包括等电点沉降法，盐析，有机溶剂沉淀，吸附、层析、电点沉降法，盐析，有机溶剂沉淀，吸附、层析、等）等）分析鉴定。分析鉴定。 。实验步骤：实验步骤：二、二、a 细胞的破碎细胞的破碎机械方法机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：坏。常用器械有： 玻璃匀浆器玻璃匀浆器（

3、用两个磨砂面相（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎）互摩擦，将细胞磨碎） 高速组织捣碎机（转速可高速组织捣碎机（转速可达达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎动物内脏组织的破碎物理方法物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。细胞破碎的方法。 反复冻融法反复冻融法 冷热变替法冷热变替法 超超声波法声波法化学及生物化学方法化学及生物化学方法 玻璃匀浆机玻璃匀浆机b、细胞器的分离、细胞器的分离 细胞器的分离一般采用差速细胞器的分离一般采用差速离心离心法。细法。细胞经过破碎后，在适当介

4、质中进行差速胞经过破碎后，在适当介质中进行差速离心。离心。 从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的，从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的，需进一步纯化。纯化包括将蛋白质与非蛋白质需进一步纯化。纯化包括将蛋白质与非蛋白质分开，将各种不同的蛋白质分开。选择提取条分开，将各种不同的蛋白质分开。选择提取条件时，就要考虑尽量除去非蛋白质。一般总是件时，就要考虑尽量除去非蛋白质。一般总是有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质（如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后（如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后操作。常用有机溶剂提取除去。操作。常用有机溶剂提取除去。 三、蛋

5、白质粗提取三、蛋白质粗提取三、蛋白质粗提三、蛋白质粗提取取原理原理：利用蛋白质在：利用蛋白质在PH等电点时的溶等电点时的溶解度最小，因而会以沉淀的方式析出。解度最小，因而会以沉淀的方式析出。试剂：柠檬酸、磷酸氢二钠试剂：柠檬酸、磷酸氢二钠步骤步骤：1向试管中加入磷酸氢二钠和柠檬酸，使其向试管中加入磷酸氢二钠和柠檬酸，使其PH=4。2将提取的溶液加入到第将提取的溶液加入到第1步骤所配的缓冲液中。步骤所配的缓冲液中。3静置一段时间，待沉淀完全。静置一段时间，待沉淀完全。4过滤或离心出粗产品。过滤或离心出粗产品。：防止局部过酸或过碱造成蛋白质变性。：防止局部过酸或过碱造成蛋白质变性。金属螯合亲和层析

6、金属螯合亲和层析 固定化金属螯合亲和层析是建立在蛋白质表面固定化金属螯合亲和层析是建立在蛋白质表面的氨基酸与固定化金属离子的亲和力的不同来进行的氨基酸与固定化金属离子的亲和力的不同来进行蛋白质分离的一项技术。过渡态金属离子能够与电蛋白质分离的一项技术。过渡态金属离子能够与电子供体，如氮、硫、氧等原子以配位键结合，金属子供体，如氮、硫、氧等原子以配位键结合，金属离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点，当它在离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点，当它在溶液中会被水分子或阴离子占据。溶液中会被水分子或阴离子占据。 钙调蛋白的外形似哑铃钙调蛋白的外形似哑铃,有两个球形的末端有两个球形的末端,中中间被一个

7、长而富有弹性的螺旋结构相连间被一个长而富有弹性的螺旋结构相连,每个末端每个末端有两个有两个Ca2+ 结构域结构域,每个结构域可以结合一个每个结构域可以结合一个Ca2+ , 这样这样,一个钙调蛋白可以结合一个钙调蛋白可以结合4个个Ca2+ ,钙调蛋白与钙调蛋白与Ca2+ 结合后的构型相当稳定结合后的构型相当稳定 。四、精细纯化四、精细纯化值得注意的是值得注意的是，在洗脱时，会有少许配基与蛋白，在洗脱时，会有少许配基与蛋白质一同被洗脱下来，因此常在其后加一凝胶层析质一同被洗脱下来，因此常在其后加一凝胶层析以除去小分子的配基。以除去小分子的配基。 属最常用的蛋白质分离方法。系混合属最常用的蛋白质分离

8、方法。系混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。在洗柱过程中，分子量最大的物质不能进入凝胶在洗柱过程中，分子量最大的物质不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外。分子网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外。分子量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢，致使最后流出柱外。缓慢，致使最后流出柱外。 五、分析鉴定五、分析鉴定A、定性分析、定性分析B、定量分析、定量分析紫外检测法、考马斯亮蓝法、紫外检测法、考马

9、斯亮蓝法、FolinFolin- -酚试剂法（最常用方法）酚试剂法（最常用方法）Folin-酚试剂法酚试剂法包括两步反应：包括两步反应：第一步第一步是在碱性条件下，是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；铜络合物；第二步第二步是此络合物是此络合物将磷钼酸将磷钼酸-磷钨酸试剂（磷钨酸试剂（Folin 试剂）还原，产生深蓝色试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高比。此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100 倍，定量范倍，定量范围为围为5100g 蛋白质。蛋白质。Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色试剂显色反