DNA甲基化与癌症

1、DNA甲基化与癌症甲基化与癌症2018.07.25 表观遗传学与DNA甲基化 DNA甲基化的检测手段 DNA甲基化与癌症一、表观遗传学与DNA甲基化基因型相同基因型相同现象现象1 1：一个生物体的不同组织基因表达模式截然不同一个生物体的不同组织基因表达模式截然不同表达模式迥异表达模式迥异现象2：同卵双生的孪生子具有完全相同的基因组。但他们往往在长大成人后在性格、健康方面往往存在很大差异。 现象现象3 3： 肿瘤抑制基因被过量地甲基化而导致失去活性，而基因肿瘤抑制基因被过量地甲基化而导致失去活性，而基因的的DNADNA序列并不发生变化。序列并不发生变化。现象现象4 4：橘生淮南则为橘，生于淮北则

2、为枳，叶徒相似，橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳，叶徒相似，其实味不同。同一种水果，在不同产地生长，其味其实味不同。同一种水果，在不同产地生长，其味道，大小，外观可能相差很远。道，大小，外观可能相差很远。Basket ball player？Singer？President？TV host？如果他们出生在不同如果他们出生在不同的地方的地方基因环境表型表观遗传学相同的基因型相同的基因型 不同的表型不同的表型 ? ? 什么是表观遗传学？什么是表观遗传学？ 表观遗传学：表观遗传学： 基因序列无变化基因序列无变化 基因功能发生变化基因功能发生变化 可遗传并且是可逆的可遗传并且是可逆的 表观遗传学机制：表

3、观遗传学机制： DNADNA甲基化甲基化 组蛋白修饰组蛋白修饰 RNA RNA调控（调控（RNARNA干扰，干扰，microRNA, long non-coding microRNA, long non-coding RNARNA等等) )表观遗传学表观遗传学/ /Epigenetics 基因型不变的情况下，影响表型并能遗传的现象，基因型不变的情况下，影响表型并能遗传的现象，称为表观遗传或后生遗传。称为表观遗传或后生遗传。表观遗传学研究的是在基因组表观遗传学研究的是在基因组DNA序列不变的序列不变的情况下，在表型上具有的稳定的、可遗传情况下，在表型上具有的稳定的、可遗传(或潜或潜在的可遗传性在

4、的可遗传性)的变化。的变化。 定义定义Epigenetics - On or over the genetic information encoded in the DNA在细胞基因组上存在两类信息：在细胞基因组上存在两类信息： A- 遗传学信息遗传学信息 B- 表观遗传学信息表观遗传学信息前者前者维持细胞活性功能工厂的所有物质材料维持细胞活性功能工厂的所有物质材料后者后者怎么建、何时建、在哪建的附加信息怎么建、何时建、在哪建的附加信息基因组不仅仅是序列包含遗传信息，而且其修饰也可以基因组不仅仅是序列包含遗传信息，而且其修饰也可以记载遗传信息。记载遗传信息。DNA sequence codin

5、gEpigenetic programming广泛，多样，广泛，多样，复杂复杂 DNA甲基化甲基化 染色质重塑染色质重塑 RNARNA调控（调控（RNARNA干扰，干扰， 非编码非编码RNA:microRNARNA:microRNA, , long non-coding RNA long non-coding RNA等等) )表观遗传学目前的主要研究发现表观遗传学目前的主要研究发现细胞命运个体发育疾病发生表观遗 传调控基因选 择表达表表 观观 遗遗 传传 学学基因表达前的调控：DNA甲基化、基因印记、染色质重塑基因转录后的调控：ncRNA、miRNA、反义寡核苷酸、核糖开关RNA蛋白翻译后的修

6、饰：组蛋白的甲基化和乙酰化、非组蛋白的共价修饰DNA甲基化甲基化组蛋白翻译后修饰组蛋白翻译后修饰RNA机制机制甲基化是指从活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上将甲基催化转移 到其他化合物的过程,可形成各种甲 基化合物，或是对某些蛋白质或核 酸等进行化学修饰形成甲基化产物。在生物系统内，甲基化是经酶催化 的，这种甲基化涉及基因表达的调 控、蛋白质功能的调节以及核糖核 酸(RNA)加工。甲甲 基基 化化DNA DNA 甲基化的概念及机理甲基化的概念及机理 1950年，年，Wyatt在在Nature上首次指出测序结果表明上首次指出测序结果表明DNA可能存在第可能存在第5碱基。碱基。DNA甲基转移

7、酶： DNMT胞嘧啶： Cytosine5-甲基胞嘧啶： 5-MethylctosineS-腺苷-甲硫氨酸： SAM S-腺苷- 高半胱氨酸：SAHDNMTs活性甲基化合物活性甲基化合物DNA甲基化可以发生在腺嘌呤的N-6位、 胞嘧啶的N-4位、鸟嘌呤的N-7位或胞嘧啶 的C-5位等。但在哺乳动物中DNA甲基化主 要发生在5-CpG-3的C上生成5-甲基胞嘧啶DNA甲基化（DNA methylation）DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶（DNMTs）的作用下，将一个甲基添加在DNA分子中的碱基上，最常见的是加在胞嘧啶上，由此形成5-甲基胞嘧啶（5mC）。DNA甲基化位点CpG岛或富含岛或富含

8、CpG岛的区域岛的区域CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段，CpG保持 或高于正常概率，这些区段被称作CpG岛。CCAGGCCTGGCCTTGACAGGCGGGCGGAGCAGCCAGTGCGAGACAGGGAGGCCGGTGCGGGTGCGGGAACCTGATCC GGAGGCGGGGGCGGGGCGGGGGCGCAGCGCGCGGGGAGGGGCCGGCGCCCGCCTTCCTCCCCGGGGCCCTCCGGCG TCTGCACTGCAGGAGCGCGGGCGCGGCGCCCCAGCCAGCGCGCAGGGCCCGGGCCCCGCCGGGGGCGCTTCCTCG

9、CC CCGCGCGACCCGCTGCpG岛特征：A、CpG岛主要位于基因的启动子区，部分位 于基因的第一个外显子区； B、CpG岛甲基化可以直接导致相关基因的表 观遗传学沉默。高等生物基因组甲基化特点高等生物基因组甲基化特点 1）广泛性）广泛性 2）可遗传性可遗传性 3）可逆性）可逆性 4）组织特异性）组织特异性 CpG岛岛(CpG islands) 在结构基因在结构基因5端附近的调控区段，端附近的调控区段， CG二联核苷常常二联核苷常常以成簇串联的形式排列，含量大于以成簇串联的形式排列，含量大于50%。 预测软件预测软件 http:/pbil.univ-lyon1.fr/software/

10、cpgprod_query.html http:/www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/可遗传性可遗传性DNA 修复修复基因表达的调节基因表达的调节癌基因代谢癌基因代谢 凋亡凋亡分化分化细胞周期细胞周期DNA甲基化甲基化DNADNA甲基化的功能甲基化的功能DNA甲基化的生物学意义DNA甲基化直接影响基因的活化状甲基化直接影响基因的活化状态态 DNA甲基化的生物学意义在于： A、基因表达的时空调控 B、保护基因组的稳定性表现：基因在不同时期不同身体部位特异表达I.有些基因在发育早期甲基化II.发育晚期被诱导去甲基化III.管家基因低甲基化IV.印记基因高甲基化Cp

11、G甲基化与转录活性成反比CpG岛的数目与基因密度相关人类基因组甲基化情况人类基因组甲基化情况1%- 2%的人类基因组是CpG群人类基因组CpG岛约为28890个 平均值为每Mb含1 0.5个CpG岛80%- 90%的CpG位点已被甲基化一、一、DNA甲基化干扰转录甲基化干扰转录因因子子对对DNA元件元件的的识别识别与与结合结合序列特异性的甲基化DNA结合蛋白与启动子区甲基化CpG岛结合，募集组蛋白去乙酰化酶（HDAC）， 形成转录抑制复合物，阻止转录 因子与启动子区靶序列的结合， 从而影响基因的转录。DNA甲基化抑制基因转录的机制没有甲基化基因表达没有甲基化基因表达基因启动子区域基因启动子区域

12、转录因子转录因子结合结合不能结合不能结合甲基化基因不表达甲基化基因不表达甲基化甲基化二、二、序序列列特特异性异性的的甲甲基基化化DNA结结合合蛋蛋白与白与启启动动子子区甲区甲基基化化CpG岛结岛结合合，募募集组集组蛋蛋白白 去乙酰化去乙酰化酶酶（HDAC），形成转录抑，形成转录抑制复制复合合物物，阻，阻止转止转录因子录因子与与启启动动子区靶子区靶序序列列的的结结 合，从而影响基因的转合，从而影响基因的转录录。DNA甲基化抑制基因转录的机制Sin3AMeCP2启动子基因转录因子基因表达启动子基因基因不表达染色质构型的变化伴随组蛋白的乙酰化和去 乙酰化，以调控基因转录的开关。DNA甲基化能引起染色

13、质结构、DNA构象、 DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的 改变，从而控制基因表达。三、三、DNA甲基甲基化化通过通过改改变染变染色色质结质结构构抑制抑制基基因表因表达达DNA甲基化抑制基因转录的机制二、DNA甲基化的检测手段亚硫酸氢盐测序的原理亚硫酸氢盐测序的原理1. 直接测序法直接测序法1. 直接测序法直接测序法 注： A：癌组织；B：癌旁组织；：未甲基化；：甲基化43A43BM43AE43A43BE43B(369bp)43B2. 重亚硫酸盐转化后重亚硫酸盐转化后PCR克隆测序克隆测序2. 重亚硫酸盐转化后重亚硫酸盐转化后PCR克隆测序克隆测序3. 甲基化特异性甲基化特异性PCR 3

14、. 甲基化特异性甲基化特异性PCR U M U M U M ladder100150200250MSP法检测抑癌基因法检测抑癌基因RASSF1A启动子区的甲基化启动子区的甲基化图图 MSP检测组织切片检测组织切片DNA甲基化状态电泳图片甲基化状态电泳图片甲基化特异性甲基化特异性PCR（MSP）结果，）结果，U为非甲基化，为非甲基化，M为甲基化。为甲基化。4. 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法5. 基于限制性内切酶的甲基化分析方法基于限制性内切酶的甲基化分析方法6. 基于亲和纯化的甲基化分析方法基于亲和纯化的甲基化分析方法三、DNA甲基化与癌症DNA甲基化与癌症 DN

15、A甲基化与癌症的发生发展有着密切的联系，DNA甲基化改变包括高甲基化和去（低）甲基化。 对不同肿瘤细胞的DNA分析表明，癌变细胞中出现基因突变的概率要远远低于预期，与基因突变相比，DNA甲基化改变在细胞恶变过程中可能发挥了更大的作用。DNA甲基化与癌症的发生发展有着密切的联系 高甲基化抑癌基因沉默 低甲基化原癌基因被激活CpG岛抑癌基因高甲基化抑癌基因高甲基化在肿瘤细胞中，抑癌基因启动子区域的CpG岛处于高甲基化状态，因而抑癌基因沉默，使得细胞脱离正常的细胞周期，进入肿瘤发生过程。 原癌基因激活正常细胞中，由于甲基化作用原癌基因多处于沉默状态，但在多种肿瘤细胞中，均发现原癌基因处于低甲基化状态

16、，并且低甲基化状态与其蛋白表达升高密切相关，表明低甲基化状态可使原癌基因激活。肿瘤细胞的特性： 现在认为，肿瘤细胞具有以下特征:1.逃避细胞死亡(resisting cell death)2.对生长抑制信号不敏感( evading growth suppressors )3.诱导新血管生成(inducing angiogenesis)4.无限的复制潜能(enablingreplicative immortality)5.组织浸润和转移(activatinginvasion and metastasis)6.持续的增殖信号(sustainingproliferative signaling) 另

17、外，近年的研究又提出了新的两点:能量代谢的改变(reprogramming of energymetabolism)和逃避免疫系统的破坏(evading immune destruction)以上几点在细胞发生癌变的过程中有着重要的意义.近年来的研究发现，特定基因的DNA高甲基化在这些过程中均发挥重要作用.1.逃避细胞死亡 通常情况下，细胞在接触抑制、辐射、凋亡信号分子等刺激时会发生凋亡，但是癌细胞却可以不受凋亡的控制，而大量分裂增殖. 例如，p53基因是一个重要的抑癌基因，可以促使损伤细胞发生凋亡.50%的癌症中存在p53基因的突变失活. p53基因编码区的甲基化状态容易因为脱氨基作用发生5

18、mC-T的转换.同时，INK4a/ARF基因启动子区域的甲基化可以使表达下降，导致原来受抑制的MDM2表达上升，MDM2进而结合p53并使后者发生蛋白质水平的降解，使细胞逃避p53引起的凋亡圈.DNA高甲基化与癌症高甲基化与癌症2.对生长抑制信号不敏感 细胞生长抑制因子对细胞生长的调控存在多种机制。 在丙肝病毒感染的肝细胞中，发现了丙肝病毒的核心蛋白(core protein)可引起p16基因启动子的甲基化，p16表达水平下降从而促进了细胞的分裂，在丙肝诱导的肝癌中起着重要的作用DNA高甲基化与癌症高甲基化与癌症3.诱导新血管生成 新血管的生成是癌症发生中重要的步骤.新血管生成首先需要金属蛋白

19、酶分解细胞外基质，再通过血管内皮生长因子来诱导血管生成。 组织金属蛋白酶抑制剂可以抑制金属蛋白酶的活性，同时与血管内皮生长因子结合阻止血管生成。肿瘤细胞中组织金属蛋白酶抑制剂的下调有一部分原因是由于启动子区域的甲基化引起的.血小管反应蛋白（TSP1）是另一个抑制血管生成的蛋白，TSP1基因启动子区域甲基化引起基因表达抑制，进而导致肿瘤发生过程中细胞外基质重构和血管生成.DNA高甲基化与癌症高甲基化与癌症4.无限的复制潜能 癌细胞无限的复制潜能主要与端粒酶活性的升高有关。端粒酶可以利用RNA逆转录DNA，解决DNA复制时末端缺失的问题。正常情况下端粒酶只有在受精卵和十细胞中才有活性，而肿瘤细胞大

20、多具有高活性的端粒酶。 端粒酶的重要组成部分是人端粒酶逆转录酶。它的活性与端粒酶活性高度相关. 引起人端粒酶逆转录酶激活的启动子甲基化有位置特异性，即与启动子特定部位的甲基化及相关区域整体的非甲基化相关。DNA高甲基化与癌症高甲基化与癌症5.组织浸润和转移 组织浸润和转移是细胞恶变的重要特征，近年来这力一面的研究进展迅速.细胞骨架的异常调节与肿瘤转移密切相关。 DFNAS是一个新发现的乳腺癌相关基因.DFNAS可以促进细胞凋亡，而DFNA基因启动子甲基化后的表达抑制导致了肿瘤细胞转移几率增大DNA高甲基化与癌症高甲基化与癌症6.持续的增殖信号 大部分的癌细胞不需要外界的生长刺激因子的作用就可以

21、完成增殖，原因是细胞内的信号转导通路发生了变化，导致促增殖因子作用的增强。 在结直肠癌中发现肿瘤干细胞中SFRPs的启动子区域的高甲基化使其表达抑制，引起了Wnt通路的过度激活而刺激细胞分裂，因而细胞在不需要外界生长刺激因子的作用下就可以不断增殖。DNA高甲基化与癌症高甲基化与癌症 与癌症发生过程中DNA的甲基化不同，DNA的低甲基化既包括特定基因(主要是原癌基因)的低甲基化，还包括基因组范围内以非编码重复序列为主的DNA整体水平的低甲基化.DNA低甲基化与癌症低甲基化与癌症1. 特定基因的甲基化水平降低 CT ( cancer/testis antigen genes)抗原属于MACE (

22、melanoma and germ cell expressed)基因家族，正常情况下只在生殖细胞表达。 CT抗原在多种肿瘤组织中高表达，如肺癌，胰腺癌，胃癌等。CT激活与它的启动子区域的去甲基化相关。 近年来，白血病基因，乳腺癌基因，结肠直肠癌，肾细胞癌基因肝癌基因中都发现了由启动子低甲基化所引起的肿瘤相关基因的过表达.DNA低甲基化与癌症低甲基化与癌症2.基因组范围整体DNA甲基化的降低基因组范围DNA甲基化的程度可以通过甲基化敏感的DNA酶来检测。在多种癌症当中都发现了基因组范围整体水平的DNA甲基化降低，包括许多重复序列甲基化水平的下降。正常组织细胞的甲基胞嘧啶含量约4%，而癌细胞则为

23、大约2%一3%。DNA甲基化水平的降低可以出现在肿瘤发生早期阶段。肿瘤细胞在基因缺乏区域(gene-poor areas)的DNA甲基化水平明显下降，而基因启动子区域的甲基化差异则相对较小，提示这些非编码区域的甲基化水平降低可能与肿瘤发生有更密切的关系.DNA低甲基化与癌症低甲基化与癌症DNA甲基化与癌症诊断表观遗传学的改变是细胞癌变的重要特征之一，因此，细胞DNA甲基化的变化可以作为癌症早期诊断的重要依据。甲基化生物标记的不断发现使这一技术在临床的应用成为可能。 甲基化特异的PCR技术(methylation-specific PCR MSP)的出现，使得细胞DNA甲基化水平的检测变得十分方便。DNA甲基化检测稳定性好，有组织特异性，易于检测且其异常程度常与癌症的进展相关.因此，相对于传统的基因突变检测有很大的优势。在许多癌症中都己经发现了癌症相关基因甲基化水平的改变，如外周血细胞的DNA低甲基化与膀胱癌的发生密切相关，随着全基因组甲基化图谱的绘制，相信会有更多的甲基化生物标记投入到临床癌症的诊断中。与基因的突变不同，表观遗传学的改变大都是可逆的，因此，利用药物来改变细胞的表观遗传学状态可能是治疗癌症的一条新途径。目前的甲基化酶抑制剂主要有zebularine和 5-ADC 。 5-ADC在试验中显示了对骨髓增生症、白血病和实体肿瘤都有明显的疗效。Zeb