第七章 化学检测技术

1、1第七章第七章 化学检测技术化学检测技术v根据物质的化学性质而对物质进行定量、定性测定。根据物质的化学性质而对物质进行定量、定性测定。v应用最早、最广泛的检测技术应用最早、最广泛的检测技术v简便、快速、操作容易简便、快速、操作容易2一一 、 糖类的化学检测糖类的化学检测v糖类包括多糖、双糖、单糖糖类包括多糖、双糖、单糖v单糖和某些双糖具有游离羰基单糖和某些双糖具有游离羰基还原糖还原糖v多糖和蔗糖等无还原性多糖和蔗糖等无还原性非还原糖非还原糖v糖类化学检测主要是利用游离羰基的还原性质，与试剂糖类化学检测主要是利用游离羰基的还原性质，与试剂（氧化剂）进行氧化还原反应而进行测定的。（氧化剂）进行氧化

2、还原反应而进行测定的。v非还原糖必须转化为还原糖再进行测定非还原糖必须转化为还原糖再进行测定3v最常用的试剂：最常用的试剂：斐林（斐林（Fehling）试剂）试剂v基本组成：基本组成： A A：CuSOCuSO4 4溶液溶液 B: NaOHB: NaOH和酒石酸钾钠溶液和酒石酸钾钠溶液 使用时使用时A A、B B等体积混合等体积混合( (生成酒石酸钾钠铜）生成酒石酸钾钠铜）v酒石酸钾钠铜是氧化剂，可与还原糖的游离羰基发生酒石酸钾钠铜是氧化剂，可与还原糖的游离羰基发生氧化还原反应，而进行糖的测定氧化还原反应，而进行糖的测定。4定糖常用方法定糖常用方法v1 1、兰兰爱农爱农（Lane-EynonL

3、ane-Eynon）法）法 次甲基蓝（亚甲基蓝、四甲基蓝）法、次甲基蓝（亚甲基蓝、四甲基蓝）法、（置换法、直接滴定法）（置换法、直接滴定法）v反应终点用反应终点用次甲基蓝指示剂次甲基蓝指示剂显示（还原糖滴定斐林试剂，由显示（还原糖滴定斐林试剂，由于次甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜全部还原后，过于次甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜全部还原后，过量量1D还原糖使次甲基蓝还原，蓝色消失）还原糖使次甲基蓝还原，蓝色消失）v多糖或其他非还原糖需转化为还原糖后再滴定如淀粉，可用酸解或酶解5操作要点操作要点v（1 ）斐林试剂的标定）斐林试剂的标定（a）标定预备试验）标定预备试验 A、B各各5mL10m

4、L水（水（250mL三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，2D1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（萄糖液（0.1或或0.2）V1mL。（b）标定）标定 A、B各各5mL10mL水（水（250mL三角瓶中）摇匀，从滴定管中预先加三角瓶中）摇匀，从滴定管中预先加入（入（V1-1)mL标准葡萄糖液，摇匀后加热至沸腾，标准葡萄糖液，摇匀后加热至沸腾，2D1次甲基蓝次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在1min内完成），记内完成），记录消耗标准葡萄糖液的总

5、毫升数录消耗标准葡萄糖液的总毫升数V06v(2) 定糖定糖（a）定糖预备试验）定糖预备试验 A、B各各5mL10mL样品糖液（样品糖液（250mL三角瓶中）摇匀，加热至沸三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，腾，2D1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（耗标准葡萄糖液（0.1或或0.2）V2mL。v（b）定糖）定糖 A、B各各5mL10mL样品糖液（样品糖液（250mL三角瓶中）摇匀，补加三角瓶中）摇匀，补加（V0-V2）mL水，并从滴定管中预先加入（水，并从滴定管中预先加入（V2-1)mL标准葡萄糖液，标准葡萄糖液，摇匀后加热加热至沸

6、腾，摇匀后加热加热至沸腾，2D1次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在液滴定至蓝色消失（滴定在1min内完成），记录消耗标准葡萄糖内完成），记录消耗标准葡萄糖液的总毫升数液的总毫升数V。7 (3) 计算计算v还原糖含量（以葡萄糖计）还原糖含量（以葡萄糖计） （V0-V) c (1/10 )n注意：注意：（a）AB分开储存，防止分开储存，防止Cu+变化，临用混合变化，临用混合（b）单标移液管吸液准确，外壁也需擦干净）单标移液管吸液准确，外壁也需擦干净（c）体积需控制在一定范围内，对）体积需控制在一定范围内，对pH有影响有影响（d）煮沸时间要一致）煮沸时间要一

7、致（e）注意指示剂加入时间和加入量一致）注意指示剂加入时间和加入量一致（f）滴定速度一致（后滴定）滴定速度一致（后滴定0.51mL，1min内完成）内完成）（g）产物）产物Cu2O不稳定，次甲基蓝变色也不稳定，暴露于空气不稳定，次甲基蓝变色也不稳定，暴露于空气或沸腾颜色变化，滴定过程不能摇动，不可中途中止加热或沸腾颜色变化，滴定过程不能摇动，不可中途中止加热 8v斐林试剂快速法斐林试剂快速法： 在斐林试剂中加入在斐林试剂中加入亚铁氰化钾（黄血盐）亚铁氰化钾（黄血盐）反应终点反应终点为蓝色消失，淡黄色出现。反应终点比兰爱农法更为蓝色消失，淡黄色出现。反应终点比兰爱农法更为明显为明显。92、 碘量

8、法碘量法vI2 NaIO(氧化剂）氧化剂）其氧化能力较弱，仅适用于醛糖的测定，与酮糖不起反应其氧化能力较弱，仅适用于醛糖的测定，与酮糖不起反应v操作要点：操作要点：（1）标准硫代硫酸钠溶液配制，）标准硫代硫酸钠溶液配制，0.05 mol/L，沸腾后冷却水，沸腾后冷却水配制，存放在棕色瓶中，一周后用标准重铬酸钾标定。配制，存放在棕色瓶中，一周后用标准重铬酸钾标定。（2）标准碘液配制，）标准碘液配制，0.1mol/L（3）空白滴定：空白液，用硫代硫酸钠滴定试剂中全部碘）空白滴定：空白液，用硫代硫酸钠滴定试剂中全部碘10 碘量瓶中，碘量瓶中，10mL0.1mol/L10mL0.1mol/L碘液碘液1

9、5mL0.1 mol/LNaOH15mL0.1 mol/LNaOH5mL5mL空白空白液，摇匀后暗反应液，摇匀后暗反应15min15min1mL1mol/L1mL1mol/L硫酸溶液，用硫酸溶液，用0.05mol/L0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至浅黄色，加硫代硫酸钠滴定至浅黄色，加0.2mL0.50.2mL0.5淀粉液作指示剂，滴淀粉液作指示剂，滴定至蓝色消失，记录定至蓝色消失，记录V V0 0v(4)(4)样品滴定：以样品滴定：以5mL5mL样品液代替空白液，样品液代替空白液， V V1 1v(5) (5) 计算：计算：v醛糖含量醛糖含量 （V V0 0 V V1 1）C C M M n

10、 nv注意：暗反应后需酸化再滴定，滴定时开始轻摇（碘挥发），注意：暗反应后需酸化再滴定，滴定时开始轻摇（碘挥发），后再摇（淀粉吸附碘）后再摇（淀粉吸附碘）v配合次甲基蓝法测定某些糖含量（如：果糖）配合次甲基蓝法测定某些糖含量（如：果糖）113、 铜试剂法铜试剂法 将还原糖与二价铜离子反应生成的将还原糖与二价铜离子反应生成的Cu2O用碘氧化，再用用碘氧化，再用硫代硫酸钠滴定反应液中剩余的碘而测定样品还原糖的含量。硫代硫酸钠滴定反应液中剩余的碘而测定样品还原糖的含量。v（1）铜试剂的配制）铜试剂的配制 主要提供二价铜离子及碘主要提供二价铜离子及碘v（2）标准曲线的制作）标准曲线的制作12v(a)标

11、准葡萄糖液的配制标准葡萄糖液的配制 0.1%或或0.05（根据所用铜离子试剂定）（根据所用铜离子试剂定）v(b)三角瓶编号三角瓶编号 1 2 3 4 5 6 葡萄糖标准液（葡萄糖标准液（mL ) 0 1 2 3 4 5 蒸馏水（蒸馏水（mL ) 5 4 3 2 1 0 铜试剂（铜试剂（mL ) 5 5 5 5 5 5 沸水浴沸水浴10min，冷却至室温，冷却至室温,v(c)各加入各加入0.5mol/L硫酸硫酸5mL，振荡，待红色，振荡，待红色Cu2O完完全溶解后，用硫代硫酸钠滴定至终点，记录耗用量全溶解后，用硫代硫酸钠滴定至终点，记录耗用量Vv(d) 绘标准曲线绘标准曲线v葡萄糖含量（葡萄糖含

12、量（mg）为纵坐标，（）为纵坐标，（V0-V)为横坐标为横坐标13二、二、 蛋白质和氨基酸的化学检测蛋白质和氨基酸的化学检测v蛋白质含氮量几乎恒定，平均蛋白质含氮量几乎恒定，平均16v测出测出N含量含量6.25，即为蛋白质量，即为蛋白质量eg： 含氮量含氮量 每克每克N相当蛋白质量相当蛋白质量肉、蛋、豆肉、蛋、豆 16 6.25v面粉面粉 17.6 5.70v奶品奶品 15.7 6.38v花生花生 18.2 5.50v鲑精蛋白鲑精蛋白 31.5 3.1714蛋白质常用检测方法蛋白质常用检测方法1、定氮法（经典的，仲裁的）定氮法（经典的，仲裁的） 凯氏定氮法或微量凯氏定氮法凯氏定氮法或微量凯氏定

13、氮法（1）原理）原理 消化、蒸馏、吸收、滴定计算消化、蒸馏、吸收、滴定计算（2）操作要点）操作要点 (a) 消化消化：目的：使样品中的蛋白质分解，其中氮与硫酸目的：使样品中的蛋白质分解，其中氮与硫酸反应生成反应生成(NH4)2SO4 凯氏定氮瓶，样品K2SO4-CuSO4、浓H2SO4, 通风厨内进行，消化液全部移入100mL容量瓶定容。1516(b)(b)蒸馏蒸馏：目的：碱化蒸馏使氨游离。：目的：碱化蒸馏使氨游离。加1050ml 30%氢氧化钠，防止漏气。(c)(c)吸收吸收：5mL 25mL 2H H3 3BOBO3 3吸收或一定量标准酸溶液（如吸收或一定量标准酸溶液（如25mL 25mL

14、 0.05mol/L H0.05mol/L H2 2SOSO4 4) )甲基红溴甲酚绿几滴甲基红溴甲酚绿几滴 (d)(d)滴定计算滴定计算： 若若H H3 3BOBO3 3吸收：吸收：0.01mol/L Hcl0.01mol/L Hcl滴定至绿色滴定至绿色 淡紫红色淡紫红色 样品中的总氮量（样品中的总氮量（mg)=mg)=（A-B)A-B)C C1414n n 若标准硫酸接收：若标准硫酸接收：0.1mol/L0.1mol/L标准标准NaOHNaOH滴定，甲基红滴定，甲基红黄黄色终点色终点 样品中总氮量样品中总氮量=（C1V1-C2V2) 14nv粗蛋白含量样品的总氮量粗蛋白含量样品的总氮量6.

15、25172、双缩脲试剂法、双缩脲试剂法蛋白质含有两个以上脲键，有双缩脲反应：蛋白质含有两个以上脲键，有双缩脲反应：蛋白质（多肽）蛋白质（多肽） CuSO4 （ NaOH） 铜钠双铜钠双缩脲络合物（紫红色络合物）缩脲络合物（紫红色络合物）vA Cp，与蛋白质的分子量和氨基酸组成无关，与蛋白质的分子量和氨基酸组成无关vTris缓冲液干扰缓冲液干扰P的测定的测定，测定范围测定范围110 mg/mL18v操作操作：v（1）双缩脲试剂的配制）双缩脲试剂的配制 CuSO4、酒石酸钾钠、酒石酸钾钠、NaOH、0.1%KIv (2) 标准曲线的制作标准曲线的制作1标准酪蛋白标准酪蛋白(mL) 0 0.2 0.

16、4 0.6 0.8 1.0蒸馏水蒸馏水(mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0双缩脲试剂双缩脲试剂 (mL) 4 4 4 4 4 4室温反应室温反应30min测测A540v (3)样品测定：样品测定： 1mL4mL双缩脲试剂双缩脲试剂 ，30min，测，测A540193、福林酚试剂法、福林酚试剂法v是双缩脲法的发展，灵敏高100倍，需时较长，而且对双缩脲反应有干扰的物质对其影响更大，酚类和柠檬酸也有干扰。v原理：原理： （1）碱性铜试剂）碱性铜试剂双缩脲反应双缩脲反应 （2）稀释的苯酚试剂）稀释的苯酚试剂与酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基与酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸反应呈蓝色酸反应呈蓝

17、色 （3）两种呈色反应可叠加）两种呈色反应可叠加20v操作：操作：（1）福林酚试剂的配制）福林酚试剂的配制 甲液：碱性铜试剂（甲液：碱性铜试剂（A、NaOH、NaCO3, B、CuSO4和酒和酒石酸钾钠石酸钾钠) 乙液：稀释的苯酚试剂乙液：稀释的苯酚试剂（2）标准蛋白溶液配制）标准蛋白溶液配制 结晶牛血清蛋白溶于结晶牛血清蛋白溶于0.9NaCl或用酪蛋白（凯氏定氮法或用酪蛋白（凯氏定氮法测定含量）测定含量）（3）标准曲线制作）标准曲线制作（4）样品测定）样品测定 1mL样品（含样品（含P15500 g）5mL甲液，室温甲液，室温10min，乙液乙液0.5mL，混匀，室温，混匀，室温30min，

18、测，测A50075021氨基酸含量测定方法氨基酸含量测定方法v1、茚三酮显色法、茚三酮显色法 微酸性条件下，氨基酸茚三酮反应生成紫色化微酸性条件下，氨基酸茚三酮反应生成紫色化合物，亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）茚三酮反应合物，亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）茚三酮反应生成黄色化合物生成黄色化合物。v蛋白质、多肽和氨基酸均可发生印三酮反应。蛋白质、多肽和氨基酸均可发生印三酮反应。v取取1mL样品溶液（含氨基酸样品溶液（含氨基酸0.150ug)加加1mL缓冲液缓冲液（pH5.06.7），再加），再加1mL茚三酮显色液，茚三酮显色液，100 水浴水浴15min，自来水冷却后，加入，自来水冷却后，加入3mL

19、60乙醇溶液，测定乙醇溶液，测定OD570，脯氨酸或羟脯氨酸测，脯氨酸或羟脯氨酸测OD440222 、甲醛滴定法、甲醛滴定法v氨基酸是两性电解质，不能用一般酸碱指示剂通过氨基酸是两性电解质，不能用一般酸碱指示剂通过氢氧化钠来测定氢氧化钠来测定。v加甲醛生成羟甲基衍生物，可以用碱滴定加甲醛生成羟甲基衍生物，可以用碱滴定。v注意：需用过量中性甲醛注意：需用过量中性甲醛。23三、三、 核酸的化学检测核酸的化学检测v根据核酸所含的磷及戊糖的化学性质，可用定磷法、根据核酸所含的磷及戊糖的化学性质，可用定磷法、二苯胺法和地衣酚法等进行检测二苯胺法和地衣酚法等进行检测。v1、定磷法定磷法 （1）核酸的消化）

20、核酸的消化 （2）磷的测定）磷的测定 定磷试剂，45 水浴25min，冷却至室温测OD650 无机磷标准液作标准曲线 （3）核酸含量的计算）核酸含量的计算 一般一般DNA含磷含磷9.5,RNA含磷含磷9.2， RNA量（总磷量无机磷量）量（总磷量无机磷量）10.9 DNA量量 （总磷量无机磷量）（总磷量无机磷量）10.5242、二苯胺法测定、二苯胺法测定DNA含量含量 DNA中的中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在一起加热产生蓝色反应，在595nm处有最大吸收峰。处有最大吸收峰。在在40400 g范围内，范围内，OD595与与DNA浓

21、度成正比。浓度成正比。（1）二苯胺试剂的配制）二苯胺试剂的配制（2）标准曲线制作）标准曲线制作（3）样品）样品DNA含量测定含量测定253、 地衣酚法测定地衣酚法测定RNA含量含量 RNA在浓盐酸和三氯化铁的存在下，与在浓盐酸和三氯化铁的存在下，与3，5二羟甲二羟甲苯（地衣酚）反应，生成绿色物质。一定浓度范围内，苯（地衣酚）反应，生成绿色物质。一定浓度范围内，OD670与与RNA浓度成正比。浓度成正比。 所有戊糖均可进行此反应，注意干扰（如DNA）。v操作：操作： 地衣酚试剂配制；标准曲线制作；样品地衣酚试剂配制；标准曲线制作；样品RNA测定测定26三、蛋白质的免疫化学检测三、蛋白质的免疫化学

22、检测 利用抗原与抗体之间特异的结合反应而对蛋白质进行定性利用抗原与抗体之间特异的结合反应而对蛋白质进行定性定量分析技术。定量分析技术。一、一、抗原抗原-抗体反应抗体反应（antigen-antibody reaction）是指抗原与相是指抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合反应应抗体在体内或体外发生的特异性结合反应。 反应的特点：反应的特点：可逆性可逆性最适比例最适比例特异性特异性敏感性敏感性27v（1）凝集反应）凝集反应 效价测定，细菌、病毒分类效价测定，细菌、病毒分类v（2）沉淀反应）沉淀反应 沉淀反应、界面（环状）试验、免疫扩散、沉淀反应、界面（环状）试验、免疫扩散、 免疫电泳、免

23、疫电泳、免疫亲和层析、免疫荧光检测等免疫亲和层析、免疫荧光检测等v（3）免疫标记）免疫标记二、蛋白质的免疫化学检测方法二、蛋白质的免疫化学检测方法28 1、凝集反应、凝集反应 v凝集反应凝集反应（agglutination）是指细菌、红细胞等是指细菌、红细胞等颗粒性颗粒性抗原抗原与相应抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的凝聚物。与相应抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的凝聚物。其中参与反应的抗原称为其中参与反应的抗原称为凝集原凝集原，其抗体称为，其抗体称为凝集素凝集素。29v直接凝集直接凝集：细菌或红细胞与相应抗体直接反应，可出现凝集现象。v间接凝集反应间接凝集反应：将可溶性抗原包被在与免

24、疫无关的载体颗粒表面，再与相应抗体反应出现颗粒物凝集现象。 v间接凝集抑制试验间接凝集抑制试验：将待测抗原与特异性抗体先行混合并作用一定时间，再加入相应致敏载体悬液。若待测抗原与抗体对应，即发生中和，随后加入的相应致敏载体颗粒不再被凝集，使本应出现的凝集现象被抑制。3031 2、沉淀反应、沉淀反应v可溶性抗原可溶性抗原沉淀反应（沉淀反应（precipitation）:可溶性可溶性抗原与抗原与相应的抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的沉相应的抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的沉淀。淀。v包括：血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液、各种微生物蛋包括：血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液、各种微生物蛋

25、白分子等。白分子等。v反应特点：比例性反应特点：比例性v包括：沉淀试验、界面试验、免疫扩散包括：沉淀试验、界面试验、免疫扩散（单向免疫扩散、双向免疫扩散）、免疫电泳、免疫亲和层析、（单向免疫扩散、双向免疫扩散）、免疫电泳、免疫亲和层析、免疫荧光免疫荧光32沉淀试验沉淀试验界面试验界面试验33343、免疫标记、免疫标记v免疫标记技术免疫标记技术（immunolabelling technique） 用荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质等标记用荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质等标记抗体或抗原，进行抗原抗体反应的检测。抗体或抗原，进行抗原抗体反应的检测。 35v常用的免疫标记物质：常用的免疫标

26、记物质： 荧光素荧光素, 酶酶, 放射性核素放射性核素 , 金属颗粒金属颗粒 v具体检测分为具体检测分为 ：免疫荧光法、酶免疫测定免疫荧光法、酶免疫测定 、 放射免疫测定法、化学发光免疫分析、免疫印迹法放射免疫测定法、化学发光免疫分析、免疫印迹法36（1 1）免疫荧光法）免疫荧光法v免疫荧光法免疫荧光法（immunofluorescence,IF）用用荧荧光素光素与抗体连接成荧光素标记抗体，再与待测样品与抗体连接成荧光素标记抗体，再与待测样品中的抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复中的抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发荧光，借此对抗原进行定性或定位合物散发荧光，借此对抗原进行定性或定位 v包括包括：直接荧光法、间接荧光法直接荧光法、间接荧光法373839（2）酶免疫测定）酶免疫测定v酶免疫测定酶免疫测定（enzyme immunoassay）：即即将抗原将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，借助于结合，借助于酶酶作用于底物的显色反应判定结果。作用于底物的显色反应判定结果。可以通过酶标测定仪测定光密度（可以通过酶标测定仪测定光密度（OD）值，反应）值，反应抗原含量，达到定量分析