生物实验室常用技术参数资料

1、实验室常用技术参数资料、核酸及蛋白质常用数据1核苷三磷酸的物理常数化合物分子 量 max(pH7.0)1 摩尔溶液 （ pH7.0 ）中 max时的最大吸 收值OD280/OD 260ATP507259154000.15CTP48327190000.97GTP523253137000.66UTP484262100000.38dATP494259152000.15dCTP46727193000.98dGTP507253137000.66dTTP48226796000.712常用核酸的长度与分子量核酸核苷酸数分子量 DNA48502 （双链环状）3.0 ×107pBR3224363 （双

2、链）2.8 ×10628SrRNA480061.6 ×10623SrRNA37001.2 ×10618SrRNA190056.1 ×10519SrRNA170055.5 ×1055SrRNA12043.6 ×104tRNA（大肠杆菌）7542.5 ×104( 1)重量换算1g=10-6g1ng=10 -9g3常用核酸蛋白换算数据-121pg=10 g1fg=10 -15g2）分光光度换算：1A260 双链 DNA=50 g/ml1A260 单链 DNA=30 g/ml1A260 单链 RNA=40 g/ml（ 3）DNA 摩

3、尔换算：1 g 100bp DNA=1.52pmol=3.03pmol 末端1 g pBR322 DNA=0.36pmol1pmol 1000bp DNA=0.66g=6.6×105 道尔顿5=3.3×105 道尔顿=3.4×105 道尔顿1pmol p BR322=2.8g 1kb 双链 DNA （钠盐） 1kb 单链 DNA （钠盐） 1kb 单链 RNA（钠盐） （ 4）蛋白摩尔换算：100pmol 分子量 100 ，000 蛋白质 =10g100pmol 分子量 50， 000 蛋白质 =5g100pmol 分子量 10， 000 蛋白质 =1g氨基酸的平

4、均分子量 =126.7 道尔顿（ 5）蛋白质 /DNA 换算：1kb DNA=333 个氨基酸编码容量 =3.7 ×104MW 蛋白质10 ， 000MW 蛋白质 =270bp DNA30 ， 000MW 蛋白质 =810bp DNA50， 000MW 蛋白质 =1.35kb100 ， 000MW 蛋白质 =2.7kb DNA4常用蛋白质分子量标准参照物（1）高分子量标准参照（ 2）中分子量标准参照（3）低分子量标准参照肌球蛋白分子量磷酸化酶 B97，400碳酸酐酶31，00肌球蛋白212 ， 000牛血清白蛋白66，200大豆脻蛋白酶21，500- 半乳糖甘酶 B116 ， 000

5、谷氨酶脱氢酶55，000抑制剂磷酸化酶 B97，400卵白蛋白42，700马心肌球蛋白16，900牛血清白蛋白66，200醛缩酶40，000溶菌酶14，400过氧化氢酶 57，000碳酸酐酶31，000肌球蛋白（ F1）8，100醛缩酶40，000大豆脻蛋白酶21，500肌球蛋白（ F2）6，200抑制剂肌球蛋白（ F3）2，500溶菌酶14，4005常用 DNA 分子量标准参照物 DNA/Hind DNA/EcoR /Hind +EcoR pBR322/Hae 231302122621227587123941674215148405104655758044973504894361564342

6、68458802322484335304346420273530202726757564190423451125158421321137519218974184118311247564125续上表pBR322/Hinf 174/Hinf 174/Hae 174/Tap16317261401353291451771311810781175506553100872404396500826033273444176631023129841348281141221311422718722024940234541542002419433751511182072二、常用缓冲液1分子 克隆 常用缓冲液1)25

7、 下 0.1mol/L 磷酸钾缓冲液的配制2)25 下 0.1mol/L 磷酸钠缓冲液的配制2磷酸缓冲液pH1mol/L K 2HPO4(ml)1mol/L KH 2PO4(ml)5.88.591.56.013.286.86.219.280.86.427.872.26.638.161.96.849.750.37.061.538.57.271.728.37.480.219.87.686.613.47.890.89.28.094.06.2pH1mol/L Na 2HPO4(ml)1mol/L NaH 2PO4(ml)5.87.992.16.012.088.06.217.882.26.425.574

8、.56.635.264.86.846.353.77.057.742.37.268.431.67.477.422.67.684.515.57.889.610.48.093.26.8 : 用蒸馏水将混合的两种 1mol/L 贮存液稀释至 1000ml ，根据 Henderson-Hasselbalch 方程计算其 pH 值：pH=pK'+1g( 质子受体 / 质子供体 )在此， pK'=6.86(25 )。3电泳缓冲液测序凝胶加样缓冲液98% 去离子甲酰胺10mol/L EDTA(pH8.0)0.025% 二甲苯青 FF0.025% 溴酚蓝甲酰胺：许多批号的试剂级甲酰胺，其纯度符合

9、使用要求，无须再进行处理。不过，一 旦略呈黄色，则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与Dowex XG 8混合床树脂共同搅拌 1 小时进行去离子处理， 并用 Whatman 1 号滤纸过滤 2次，去离子甲酰胺分装成小份， 充氮存于 -70 。常用的电泳缓冲液缓冲液使用液浓贮存液（每升）Tris- 乙酸（ TAE）1×： 0.04mol/L Tris- 乙酸50 ×：242g Tris 碱0.001mol/L EDTA57.1ml 冰乙酸100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)Tris-磷酸（ TPE）1 ×:0.09mol/L Tris- 磷酸10 ×

10、;:10g Tris 碱0.002mol/L EDTA15.5ml85% 磷酸( 1.679g/ml )40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)Tris- 硼酸( TBE) a0.5 ×0.045mol/L Tris- 硼酸5×： 54g Tris 碱0.001mol/L EDTA27.5 硼酸20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)碱性缓冲液 b1 ×:50mmol/L NaOH1×:5ml 10mol/L NaOH1mmol/L EDTA2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)Tris- 甘氨酸 c1 ×:25

11、mmol/L Tris5 ×:15.1g Tris250mmol/L 甘氨酸94g 苷氨酸（电泳级）（ pH8.3 ）0.1% SDS50ml 10% SDS( 电泳级 )说明： TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物， 为避免这一问题， 可在室温下用玻璃瓶保存 5× 溶液，出现沉淀后则予以废弃。以片都以 1×TBE 作为使用液（即 1：5 稀释浓贮液）进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5 ×的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以1：10 稀释的贮存液作为使用液。进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小， 故通过缓冲液的电流量通常较大，需要 使用

12、 1×TBE 以提供足够的缓冲容量。 碱性电泳缓冲液应现用现配。 Tris-甘氨酸缓冲液用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳。2×SDS 凝胶加样缓冲液：100mmol/L Tris ·HCl（6.8）200mmol/L 二硫苏糖醇（ DTT ）4%SDS （电泳级）0.2% 溴酚蓝20% 甘油不含 DTT 的 2×SDS 凝胶加样缓冲液可保存于室温，应在临用前取1mol/L 贮存液现加于上述缓冲液中。4凝胶加样缓冲液缓冲液类型6×缓冲液贮存温度0.25% 溴酚蓝0.25% 二甲苯青 FF440% （W/V ）蔗糖水溶液0.25 溴酚蓝0.25% 二

13、甲苯青 FF室温15% 聚蔗糖 (Ficoll400)0.25% 溴酚蓝40.25% 二甲苯青 FF30% 甘油水溶液0.25% 溴酚蓝440%（W/V） 蔗糖水溶液碱性加样缓冲液 :300mmol/L NaOH6mmol/L EDTA18% 聚蔗糖 (Ficoll400)0.15% 溴甲酚绿40.25% 二甲苯青 FF使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三： 增大样品密度； 以确保 DNA 均匀进入样品孔内； 使样品呈现颜色， 从而使加样操作更为便利， 含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染 料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的 2.2 倍，而与琼脂糖浓度无关。以0.5 ×

14、TBF 作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp 的双链线状 DNA 相同，而二甲苯青 FF 的泳动则与长 4kb 的双链线状 DNA 相同。在琼脂糖浓度为 0.5% 1.4% 的 范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。 但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染 料，因为在碱性 pH 条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。5各种 pH 值的 Tris 缓冲液的配制各种 pH 值的 Tris 缓冲液的配制所需 pH 值（ 25）0.1mol/L HCl 的体积714577244773434744207540376385773667834579

15、320802928.126.28.222.98.319.98.417.28.514.78.612.48.710.38.88.58.97.0某一特定 pH 值的 0.05mol/L Tris 缓冲液的配制：将 50ml 0.1mol/L Tris 碱溶液与上表 所示相应体积（单位： ml）的 0.1ml/L HCl 混合，加水将体积调至 100ml2）温度对 50mmol/L Tris ·HCl 液 pH 值的影响425378175728276738377748478758579768680778781788882798983809084819185829286839387849488

16、856）常用缓冲液的 pKa 值缓冲液分子量pKa 值缓冲范围Trisa12.18.087.1 7.9HEPESb283.37.477.2 8.2MPOSc209.37.156.6 7.8PIPESd304.36.766.2 7.3MESe195.26.095.4 6.8a：三羟甲基氨基甲烷； b： N-2- 羟乙基哌嗪 - N'-2-乙磷酸； c： 3- （ N-吗啉代）丙磺酸； d：N，N'-双（ 2-乙磺酸）哌嗪； e： 2- （ N-吗啉代）乙磺酸。7温度对常用缓冲液 pH 的影响缓冲体系pKa(20 ) pKa/10 Mes6.15-0.110Ada6.60-0.11

17、0PiPes6.80-0.085Aces6.90-0.200Bes7.15-0.160Mops7.20-0.013Tes7.50-0.200Hepes7.55-0.014Tricine8.15-0.210Tris8.30-0.310Bicine8.35-0.180Glycylglycine8.40-0.280三、常用酶的配制1溶菌酶用水配制成 50mg/ml 的溶菌酶溶液， 分装成小份并保存于 -20 。每一小份一经使用后 便予丢弃。2蛋白水解酶类贮存液贮存温度反应浓度反应缓冲液温度预处理0.01mol/L Tris(pH7.8)链霉蛋白 酶a20mg/ml-20 （溶于 水）1mg/ml0.

18、01mol/L EDTA37自消化 b0.5% SDS0.01mol/L Tris(pH7.8)蛋白酶 Kc20mg/ml-20 （溶于 水）50 g/ml0.005mol/L EDTA3756无须预处理0.5% SDSa：链霉蛋白酶是从链球菌（ Streptomyces griseus ）中分离到的一种丝氨酸酶和酸性蛋 白酶的混合物。b：自消化可消除 DNA 酶和 RNA 酶的污染，经自消化的链酶蛋白酶的配制方法如下： 把该酶的粉末溶解于 10mmol./l Tris ·HCl（pH7.5） 、 10mmol/l NaCl 中，配成 20mg/ml 浓度， 于 37温育 1h。经消

19、化的链霉蛋白酶分装成小份放在密封试管中，保存-20 。c：蛋白酶 K 是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，从林伯氏白色念球菌（Tritirachiumalbum Limber ）中纯化得到。该酶有两个 Ca2+ 结合位点，它们离酶的活性中心有一定距离， 与催化机理并无直接关系。然而，如果从该酶中除去Ca2+ ，由于出现远程的结构变化，催化活性将丧失 80% 左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染酸制品的蛋白质。 所以，蛋白酶 K 消化过程中通常加入 EDTA（以抑制依赖于 Mg2+ 的核酸酶的作用）。但是， 如果要消化对蛋白酶 K 具有较强耐性的蛋白， 如角蛋白一类， 则可能需要使用含

20、有 1mmol/l Ca2+而不含 EDTA 的缓冲液。在消化完毕后、纯化核酸前要加入EGT（pH8.0 ）至终浓度为2+2mmol/L, 以鳌合 Ca2+ 。3无 DNA 酶的 RNA 酶将胰 RNA 酶（ RNA酶 A）溶于 10mmol/l Tris ·HCl（pH7.5） 、 15mmol/l NaCl 中，配成10mg/ml 的浓度，于 100 加热 15min ，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于 -20。四、常用抗生素溶液贮存液 a工作浓度抗生素浓度保存条件严紧型质粒松弛型质粒氨苄青霉素50mg/ml（ 溶于水 ）-2020g/ml60g/ml羧苄青霉素50mg/ml（

21、溶于水 ）-2020g/ml60g/ml氯霉素34mg/ml（ 溶于乙醇 ）-2025g/ml170g/ml卡那霉素10mg/ml（ 溶于水 ）-2010g/ml50g/ml链霉素10mg/ml（ 溶于水 ）-2010g/ml50g/ml四环素 b5mg/ml（ 溶于乙醇 ）-2010 g/ml50 g/mla：以水为溶剂的抗生素贮存液通过0.22 m滤器过滤除菌。以乙醇为溶剂的抗生素溶液无须除菌处理。所有抗生素溶液均应放于不透光的容器保存。b：镁离子是四环素的拮抗剂，四环素抗性菌的筛选应使用不含镁盐的培养基（如LB培养基）。五、常用贮存液的配制1 30% 丙烯酰胺溶液配制方法】将 29g 丙

22、烯酰胺和 1g N ，N'-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为 60ml 的水中。加热至 37 溶解之，补加水至终体积为 100ml 。用 Nalgene 滤器（ 0.45 m孔径）过滤除菌，查证该溶 液的 pH 值应不大于 7.0 ，置棕色瓶中保存于室温。注意】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收， 其作用具累积性。 称量丙烯酰胺和 亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。 可认为聚丙烯酰胺无毒， 但也应谨慎操作， 因为它还可 能会含有少量未聚合材料。一些价格较低的丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有一些金属离子， 在丙烯酰胺贮存液中加 入大约 0.2 体积的单床混合树脂 （MB-1Mallinck

23、rodt ），搅拌过夜， 然后用 Whatman 1 号滤 纸过滤以纯化之。在贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酰和双丙烯酸。2 40% 丙烯酰胺【配制方法】把 380g 丙烯酰胺（ DNA 测序级）和 20g N ，N'- 亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为 600ml 的蒸馏水中。继续按上述配制 30% 丙烯酰胺溶液的方法处理，但加热溶解后应以蒸馏水补 足至终体积为 1L 。【注意】见上述配制 30%丙烯酰胺的说明， 40% 丙烯酰胺溶液用于 DNA 序列测定。3放线菌素 D 溶液【配制方法】把 20mg 放线菌素 D 溶解于 4ml 100% 乙醇中， 1： 10 稀释贮存液

24、，用 100% 乙醇作空 白对照读取 OD440 值。放线菌素 D（分子量为 1255 ）纯品在水溶液中的摩尔消化系数为21，900，故而 1mg/ml 的放线菌素 D溶液在 440nm 处的吸光值为 0.182 ，放线菌素 D的贮存 液应放在包有箔片的试管中，保存于 -20 。【注意】放线菌素 D 是致畸剂和致癌剂，配制该溶液时必须戴手套并在通风橱内操作，而不能 在开放在实验桌面上进行，谨防吸入药粉或让其接触到眼睛或皮肤。药厂提供的作治疗用途的放线菌素 D 制品常含有糖或盐等添加剂。只要通过测量贮存 液在 440nm 波长处的光吸收确定放线菌素 D 的浓度，这类制品便可用于抑制自身引导作用。

25、4 0.1mol/L 腺苷三磷酸（ ATP）溶液【配制方法】在 0.8ml 水中溶解 60mg ATP, 用 0.1mol/L NaOH 调至 pH 值至 7.0 ，用蒸馏水定容 1ml ， 分装成小份保存于 -70 5 10mol/L 乙酸酰溶液【配制方法】把 770g 乙酸酰溶解于 800ml 水中，加水定容至 1L 后过滤除菌。6 10% 过硫酸铵溶液【配制方法】把 1g 过硫酸铵溶解于终量为 10ml 的水溶液中，该溶液可在 4 保存数周。7 BCIP 溶液【配制方法】把 0.5g 的 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐 （BCIP）溶解于 10ml 100% 的二甲基甲酰胺中， 保存

26、于 482×BES 缓冲盐溶液【配制方法】用总体积 90ml 的蒸馏水溶解 1.07g 盐溶液 BESN，N-双（2-羟乙基） -2- 氨基乙磺酸 、 1.6g NaCl 和 0.027g Na 2HPO4，室温下用 HCl 调节 该溶液的 pH 值至 6.96 、然后加入蒸馏 水定容至 100ml ，用 0.22 m滤器过滤除菌，分装成小份，保存于 -20 。91mol/L CaCl 2溶液【配制方法】在 200ml 蒸馏水中溶解 54g CaCl 2·6H2 O，用 0.22 m滤器过滤除菌， 分装成 10ml 小份 贮存于 -20 。【注意】制备感受态细胞时， 取出一

27、小份解冻并用蒸馏水稀释至100ml ，用 Nalgene 滤器（ 0.45 m孔径）过滤除菌，然后骤冷至 0。10 2.5mol/L CaCl 2溶液配制方法】在 20ml 蒸馏水中溶解 13.5g CaCl 2·6H2O，用 0.22 m滤器过滤除菌，分装成 1ml 小份 贮存于 -20 。11 1mol/L 二硫苏糖醇（ DTT ）溶液【配制方法】用 20ml 0.01mol/L 乙酸钠溶液 （ pH5.2 ）溶解 3.09g DTT ，过滤除菌后分装成 1ml 小份 贮存于 -20 。注意】DTT 或含有 DTT 的溶液不能进行高压处理。12脱氧核苷三磷酸（ dNTP ）溶液【

28、配制方法】把每一种 dNTP 溶解于水至浓度各为 100mmol/L 左右，用微量移液器吸取 0.05mol/l Tris 碱分别调节 每一 dNTP 溶液的 pH 值 7.0（用 pH 试纸检测），把中和后的每种 dNTP 溶液 各取一份作适当稀释， 在下表中给出的波长下读取光密度计算出每种 dNTP 的实际浓度， 然 后用水稀释成终浓度为 50mmol/L 的 dNTP，分装成小份贮存于 -70 。碱基波长（ nm ）消化系数（ ）L/ （mol·cm）A25941.54 ×104G25341.37 ×104C2719.10 ×103T26037.4

29、0 ×103比色杯光径为 1cm 时, 吸光度 =M13 0.5mol/l EDTA(pH8.0) 溶液配制方法】在 800ml 水中加入 186.1g 二水乙二胺四乙酸二钠（ EDTA-Na· 2H2O），在磁力搅拌器 上剧烈搅拌，用 NaOH 调节 溶液的 pH 值至 8.0 （约需 20g NaOH 颗粒）然后定容至 1L， 分装后高压灭菌备用。【注意】EDTA 二钠盐需加入 NaOH 将溶液的 pH 值调至接近 8.0 ，才能完全溶解。14 溴化乙锭（ 10mg/ml 溶液）【配制方法】在 100ml 水中加入 1g 溴化乙锭， 磁力搅拌数小时以确保其完全溶解， 然

30、后用铝箔包裹 容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。【注意】小心：溴化乙锭是强诱变剂并有中度毒性，使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套， 称量染料时要戴面罩。15 2×HEPES 缓冲盐溶液【配制方法】用总量为 90ml 的蒸馏水溶解 1.6g NaCl 、0.074g KCl 、0.027g Na2PO4·2H2O、0.2g 葡 聚糖和 1gHEPES，用 0.5mol/l NaOH 调节 pH 值至 7.05 ，再用蒸馏水定容至 100ml 。用 0.22 m滤器过滤除菌，分装成 5ml 小份，贮存于 -20 。16 IPTG 溶液【配制方法】IPTG 为异丙基硫代 - -

31、D-半乳糖苷（分子量为 238.3 ），在 8ml 蒸馏水中溶解 2g IPTG 后，用蒸馏水定容至 10ml ，用 0.22 m滤器过滤除菌，分装成 1ml 小份贮存于 -20。17 1mol/L 乙酸镁溶液【配制方法】在 800ml 水中溶解 214.46g 四水乙酸镁，用水定容至 1L 过滤除菌。18 1mol/L MgCl 2溶液配制方法】在 800ml 水中溶解 203.4g MgCl 2·6H 2O ，用水定容至 1L，分装成小份并高压灭菌备用。【注意】MgCl2极易潮解，应选购小瓶(如 100g )试剂，启用新瓶后勿长期存放。19 -巯基乙醇( BME)溶液【配制方法】

32、一般得到的是 14.4mol/L 溶液，应装在棕色瓶中保存于 4 。【注意】BME 或含有 BME 的溶液不能高压处理。20 NBT 溶液【配制方法】把 0.5g 氯化氮蓝四唑溶解于 10ml 70% 的二甲基甲酰胺中，保存于 4 。21酚 /氯仿溶液【配制方法】把酚和氯仿等体积混合后用 0.1mol/L Tris H·Cl(pH7.6) 抽提几次以平衡这一混合物，置 棕色玻璃瓶中，上面覆盖等体积的 0.01mol/l Tris H·Cl(pH7.6) 液层，保存于 4。【注意】酚腐蚀性很强， 并可引起严重灼伤， 操作时应戴手套及防护镜，穿防护服。所有操作均 应在化学通风橱

33、中进行。 与酚接触过的部位皮肤应用大量的水清洗， 并用肥皂和水洗涤， 忌 用乙醇。22 10mmol/L 苯甲基磺酰氟( PMSF)溶液【配制方法】用异丙醇溶解 PMSF成 1.74mg/ml (10mmol/L )，分装成小份贮存于 -20 。如有必要 可配成浓度高达 17.4mg/ml 的贮存液( 100mmol/L )。【注意】PMSF 严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。 一旦眼睛或皮肤接触了 PMSF，应立即用大量水冲洗之。凡被 PMSF 污染的衣物应予丢弃。PMSF 在水溶液中不稳定。应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中。PMSF 在水溶液中

34、的活性丧失速率随 pH 值的升高而加快， 且 25 的失活速率高于 4。pH 值为 8.0 时， 20mmol/l PMSF 水溶液的半寿期大约为 85min ，这表明将 PMSF溶液调节 为碱性 （pH>8.6 ）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。23 磷酸盐缓冲溶液（ PBS）溶液【配制方法】在 800ml 蒸馏水中溶解 8g NaCl 、 0.2g KCl 、1.44g Na 2HPO4和 0.24g KH 2PO4,用 HCl 调节 溶液的 pH值至 7.4 加水定容至 1L，在 15lbf/in 2（1034 ×10 5Pa）高压下蒸气灭菌 20min 。 保存

35、于室温。24 1mol/L 乙酸钾（ pH7.5 ）溶液【配制方法】将 9.82g 乙酸钾溶解于 90ml 纯水中，用 2mol/L 乙酸调节 pH 值至 7.5 后加入纯水定 容到 1L，保存于 -20 。25乙酸钾溶液（用于碱裂解）【配制方法】在 60ml 5mol/L 乙酸钾溶液中加入 11.5ml 冰乙酸和 28.5ml 水，即成钾浓度为 3mol/L 而乙酸根浓度为 5mol/L 的溶液。26 3mol/L 乙酸钠（ pH5.2 和 pH7.0 ）溶液【配制方法】在80ml 水中溶解 408.1g 三水乙酸钠，用冰乙酸调节 pH值至 5.2 或用稀乙酸调节 pH 值至 7.0 ，加水

36、定容到 1L，分装后高压灭菌。27 5mol/L NaCl 溶液配制方法】在 800ml 水中溶解 292.2g NaCl 加水定容至 1L ，分装后高压灭菌。2810% 十二烷基硫酸钠（ SDS）溶液【配制方法】在 900ml 水中溶解 100g 电泳级 SDS，加热至 68 助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的 pH 值至 7.2 ，加水定容至 1L ，分装备用。【注意】SDS 的微细晶粒易扩散， 因此称量时要戴面罩， 称量完毕后要清除残留在称量工作区和 天平上的 SDS， 10%SDS 溶液无须灭菌。29 20×SSC溶液【配制方法】在 800ml 水中溶解 175.3g NaCl

37、和 88.2g 柠檬酸钠，加入数滴 10mol/l NaOH 溶液调节 pH 值至 7.0 ，加水定容至 1L，分装后高压灭菌。30 20×SSPE溶液【配制方法】在800ml 水中溶解 17.5g NaCl 、27.6g NaH 2PO4·H2O和 7.4g EDTA ，用 NaOH溶液调 节 pH 值至 7.4（约需 6.5ml 10ml/L NaOH ），加水定容至 1L，分装后高压灭菌。31 100% 三氯乙酸溶液【配制方法】在装有 500g TCA 的瓶中加入 227ml 水，形成的溶液含有 100% （M/V）TCA。32 1mol/L Tris 溶液【配制方法

38、】在 800ml 水中溶解 121.91g Tris 碱，加入浓 HCl 调节 pH 值至所需值。pHHCl7.4 70ml7.660ml8.0 42ml应使溶液冷至室温后方可最后调定 pH 值，加水定容至 1L，分装后高压灭菌。【注意】如 1mol/L 溶液呈现黄色，应予丢弃并置备质量更好的Tris 。尽管多种类型的电极均不能准确测量 Tris 溶液的 pH 值，但仍可向大多数厂商购得合适 的电极。Tris 溶液的 pH值因温度而异，温度每升高 1， pH值大约降低 0.03 个单位。例如：0.05mol/L 的溶液在 5、25 、和 37时的 pH 值分别为 9.5 、 8.9 和 8.6

39、。33Tris 缓冲盐溶液( TBS)( 25mmol/l Tris )【配制方法】在800ml 蒸馏水中溶解 8g NaCl、0.2g KCl 和3g Tris 碱，加入 0.015g 酚并用 HCl调至5pH值至 7.4 ，用蒸馏水定容至 1L，分装后在 151bf/in2(1.034 10 5×Pa)高压下蒸汽灭菌 20min ， 于室温保存。34 X-gal 溶液【配制方法】X-gal为 5-溴-4-氯-3-吲哚-D半乳糖苷。用二基甲酰胺溶解 X-gal 配制成的 20mg/ml 的贮存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，装有 X-gal 溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光 照而被

40、破坏，并应贮存于 -20 。 X-gal 溶液无须过滤除菌。杂交试验中用于降低背景的封闭剂试剂用途Denhardt 试剂Northern 杂交使用 RNA 探针的杂交单拷贝序列的 Southern 杂交将 DNA 固定于尼龙膜上的杂交Denhardt 试剂通常配制 50 ×贮存液，过滤后保存于 -20 。可将该贮存液 10 倍稀释于预杂交液（常为含有 0.5%SDS 和 100 g/ml经变性被打断的鲑精 DNA 的 6×SSC或 6×SSPE）中。50 ×Denhardt 液中含 5g 聚蔗 糖（ Ficoll,400 型， Pharmacia ）、

41、5g聚乙烯吡咯烷酮和 5g 牛血清白蛋白（组分 V”Sigmal），加水至终体 积为 500ml 。BLOTTOGrunstein-Hogness 杂交1 ×BLOTT（牛乳转移技术优化液， Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer ）,是含 5% 胶脂奶粉和 0.02% 叠氮钠的水溶液， 应保存于 4。使用前可用预杂交液稀释 25 倍。BLOTTO 不应与高浓度的 SDS并用， 因 为后者会导致牛奶中蛋白质析出。如果杂交背景不合要求，可在杂交液中加入 NP-40 至终浓度为 1% 。BLOTTO 不能用作 Northern 杂交的封闭剂，因

42、为这一封闭剂中可能含有RNA 酶，其活性之高使人无法接受。注意：叠氮钠有毒性，取用时需戴手套小心操作。含叠氮钠的溶液应予明确标记。肝素Southern 杂交原位杂交肝素（Sigma H-7005 ，从猪中提取的二级产品或相当等级的产品） 用 4×SSPE或 4×SSC 溶解配制成 50mg/ml 的浓度，保存于 4。肝素在含有葡聚糖硫酸酯的杂交液中用作封闭剂的浓度为500g/ml ，在不含葡聚糖硫酸酯的杂交液中的浓度为 50g/ml 。经变性并被打断的鲑精 DNA southern 和 Northern 杂交把鲑鱼精子 DNA（Sigma,盐钠）溶解于水配制成 10mg/m

43、l 的浓度，必要时于室温磁力搅拌 24h 助溶。 把溶液中 NaCl 的浓度调至 0.1mol/L ，并用酚和酚 /氯仿各抽提一次，回收水相。合 DNA溶液快速通 17 号 皮下注射针头 12 次，以剪切 DNA。加入 2 倍体积用冰预冷的乙醇沉淀 DNA。离心回收 DNA 并重溶于水， 配制成 10mg/ml 的浓度，测定溶液的 OD260值并计算出精确的 DNA浓度，然后煮沸 10min ，分装成小份 保存于 -20 。使用前置沸水浴中加热 5min ，然后迅速在冰浴中骤冷。 预杂交液中应含有 100g/ml 经变性 并被打断的鲑鱼精子 DNA六、常用凝胶的技术参数1葡聚糖凝胶的某些技术数

44、据种类干颗粒直径（）分子量分级范围床体积毫 升/克干 分子筛肽及球形蛋 白质葡聚糖（线 性分子）得水值溶胀最少平衡时间（h）柱头压力 （kPa） （2.5cm 直径 柱）室温沸 水浴SephadexG-1040 1207007002 31.0 ±0.131SephadexG-1040 120150015002.5 3.51.5 ±3.531SephadexG-25粗级100 300（ 5100 目 ）中级50150（ 100200 目）1,000 5,0001005,000461.5 ±0.262细级20800（ 200400 目 ）超细1040SephadexG

45、-50粗级100 200中级501501,500 500细级208030,00010,0009115.0 ±0.362超细1040SephadexG-75401203,000 1,000 超细104070,000950,00012 157.5 ±0.52433.92 15.86SephadexG-100401204,000 1,000 超细10401,500,000150,00015 2010.0±1.04852.35 9.41SephadexG-150401205,000 1,000 20 30超细1040400,000150,00018 2215.0±

46、;1.57250.88 3.53SephadexG-200401205000 100030 401040800,000200,00020 2520.0±2.07250.39 1.572.聚丙烯酰胺凝胶的技术数据型号排阻的下限（ 分子量 ）分级分离范围（ 分子量 ）膨胀后的床体积（ml/g 干凝胶 ）膨胀所需最少时间（室温 ,h）Bio-gel-P-21,600200 2,0003.824Bio-gel-P-43,600500 4,0005.824Bio-gel-P-64,6001,000 5,0008.824Bio-gel-P-1010,0005,000 17,00012.424Bi

47、o-gel-P-3030,00020,000 50,00014.91012Bio-gel-P-6060,00030,000 70,00019.01012Bio-gel-P-100100,00040,000 100,00019.024Bio-gel-P-150150,00050,000150,00024.024Bio-gel-P-200200,00080,000 200,00034.048Bio-gel-P-300300,000100 400,00040.0483琼脂糖凝胶的技术数据型号琼脂糖含量% （ W/W ）排阻的下限（分子量）分级分离的范围（分子量）生产厂家Sepharose 4B40.

48、3 ×1063×106PharmaciaSepharose 2B22×10 6 25×10 6Sagavac 101052.5 ×1051×10 42.5 ×105SeravacSagavac 8857×1052.5 ×10 4 7×10 5Sagavac 662×1065×1042×106Sagavac 4415 ×1062×10 5 15×10 6Sagavac 226150 ×1065×105 15×

49、10 7Bio-gel A-0.5M1060.5 ×106<1 ×10 4 0.5 ×10 6Bio-RadBio-gel A-1.5M81.5 ×106<1×1041.5×106Bio-gel A-5M65×1061×1045×106Bio-gel A-15M415 ×106464×10 4 15×10 6Bio-gel A-50M250 ×1061×10550×106Bio-gel A-150M16150 ×1061×106150×1064各处凝胶所允许的最大操作压凝胶最大静水压（ kPa）SephadexG-109.8G-159.8G-259.8G-509.8G-754.95琼脂糖凝胶浓度与线性 DNA 分辨范围凝胶浓度（ % ）线性 DNA 长度（ bp