基因工程的基本操作程序ppt课件(1)

1、整理ppt1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序整理ppt补：原核细胞的基因结构补：原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子 RNA RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。并与其结合。 转录开始后，转录开始后，RNARNA聚合酶沿聚合酶沿DNADNA分子移动，并分子移动，并以以DNADNA分子的一条链为模板合成分子的一条链为模板合成RNARNA。 转录完毕后，转录完毕后，RNARNA链释放出来，紧接着链释放出来，紧接着RNARNA聚

2、聚合酶也从合酶也从DNADNA模板链上脱落下来。模板链上脱落下来。整理ppt补：真核细胞的基因结构补：真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子启动子终止子终止子内含子：内含子： 外显子：外显子： 整理ppt真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：外显子：能编码蛋白质的序列能编码蛋白质的序列内含子：内含子：不能编码蛋白质的序列不能编码蛋白质

3、的序列：有调控作用的核苷酸序列，：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的包括位于编码区上游的RNARNA 聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非编码序列：非编码序列： 包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子整理ppt原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的 编码区是间隔编码区是间隔的、的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较思思考考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？

4、细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码整理ppt整理ppt苏云金芽孢杆菌含有一苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想想一想需要做哪些工作？需要做哪些工作？苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉整理ppt整理ppt整理ppt步骤一：目的基因的获取步骤一：目的基因的获取整理ppt目的基因的分类目的基因的分类整理ppt.从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因. 人工合成

5、目的基因人工合成目的基因 .利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 2、怎样获取目的基因、怎样获取目的基因获取目的基因是实施基因工程的第一步获取目的基因是实施基因工程的第一步整理ppt 从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。为基因文库。3.3.什么叫基因文库？什么叫基因文库？整理ppt4.4.怎样构建基因文库？怎样构建基因文库？ 鸟枪法鸟枪法：反转录法：反转录法

6、： 根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法直接合成法：直接合成法：人工合成基因法人工合成基因法直接分离基因直接分离基因整理ppt限制酶限制酶基因组基因组DNADNA基因重组基因重组转化细菌转化细菌体外包装体外包装(1)(1)基因组文库基因组文库(Genomic library) (Genomic library) 是指将某种生物体的是指将某种生物体的全部基全部基因组因组DNADNA用限制性内切酶或机械用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的力量切割成一定长度范围的DNADNA片段，再与合适的载体在体外重片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，组后

7、，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文这个群体就称为该生物基因组文库库。其目的是分离有用的目的基。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。因和保存某种生物的全部基因。每个受体菌每个受体菌DNADNA分子都包含一段不同的分子都包含一段不同的外源外源DNADNA片段片段整理ppt获取方法获取方法直接分离法：直接分离法：供体细胞中的供体细胞中的DNADNA许多许多DNADNA片段片段限制酶限制酶运载体运载体 分别与分别与 载体连接载体连接受体菌的群体中储存受体菌的群体中储存分别分别 导入导入构建基因文库构建基因文库包含该生物的包含该生物的所有所有基因基因整理pptcDNA

8、( cDNA( 互补互补DNA)DNA)： 是由生物的某一特定器是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的官或特定发育时期细胞内的mRNAmRNA经体外反转录后形成的经体外反转录后形成的互补互补DNADNA片段，与载体连接片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生这个受体菌群就叫做这种生物的物的cDNAcDNA文库文库 (2)cDNA(2)cDNA文库文库 (cDNA library(cDNA library) )反转录酶反转录酶mRNAmRNA基因重组基因重组cDNAcDNA整理ppt构建构建cDNA文库文库包含该生物的包含该生物的部分部分基因

9、基因mRNA 反转录cDNA（互补DNA） DNA聚合酶双链DNA获取方法获取方法反转录法反转录法整理pptcDNA合成过程 第一步，反转录酶以第一步，反转录酶以RNARNA为模板合成一条与为模板合成一条与RNARNA互补互补的的DNADNA单链，形成单链，形成RNA-DNARNA-DNA杂交分子。杂交分子。 第二步，核酸酶第二步，核酸酶H H使使RNA-DNARNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNARNA链降解，链降解，使之变成单链的使之变成单链的DNADNA。 第三步，以单链第三步，以单链DNADNA为模板，在为模板，在DNADNA聚合酶的作用下聚合酶的作用下合成另一条互补的合成另一条

10、互补的DNADNA链，形成双链链，形成双链DNADNA分子。分子。 整理ppt基因组DNA文库cDNA文库基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较整理ppt图图书书馆馆国家图书馆国家图书馆市图书馆市图书馆基基因因文文库库基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库整理ppt基因组文库基因组文库部分基因文库如：部分基因文库如：整理ppt基因组DNA文库cDNA文库基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较整理ppt文库类型文库类型cDNAcDNA文库文库基因组文库基因组文库文库大小文库大小小小大大基因中基因中启动子启动子无无有有基因中

11、基因中内含子内含子无无有有基因多少基因多少某种生物的部分基因某种生物的部分基因某种生物的全部基因某种生物的全部基因物种之间的基物种之间的基因交流因交流可以可以部分基因可以部分基因可以说明说明基因文库的构建过程包含基因工程的基本操作基因文库的构建过程包含基因工程的基本操作步骤步骤。从基因文库中获取目的基因的优点是操。从基因文库中获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。整理ppt提问：你能推测出由提问：你能推测出由mRNAmRNA反转录形成反转录形成cDNAcDNA的过程大致分为哪些步骤吗？的过程大致分为哪些步骤吗？ 第一步，反转录

12、酶以第一步，反转录酶以RNARNA为模板合成一条与为模板合成一条与RNARNA互补互补的的DNADNA单链，形成单链，形成RNA DNARNA DNA杂交分子。杂交分子。 第二步，核酸酶第二步，核酸酶H H使使RNADNARNADNA杂交分子中的杂交分子中的RNARNA链降链降解，使之变成单链的解，使之变成单链的DNADNA。 第三步，以单链第三步，以单链DNADNA为模板，在为模板，在DNADNA聚合酶的作用下聚合酶的作用下合成另一条互补的合成另一条互补的DNADNA链，形成双链链，形成双链DNADNA分子。分子。 第一步，反转录酶以第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与为模板合成一条与R

13、NA互互补的补的DNA单链，形成单链，形成RNA DNA杂交分子。杂交分子。 第二步，核酸酶第二步，核酸酶H使使RNADNA杂交分子中的杂交分子中的RNA链链降解，使之变成单链的降解，使之变成单链的DNA。 第三步，以单链第三步，以单链DNA为模板，在为模板，在DNA聚合酶的作用聚合酶的作用下合成另一条互补的下合成另一条互补的DNA链，形成双链链，形成双链DNA分子。分子。整理ppt蛋白质蛋白质mRNADNA推测推测推测推测DNADNA合成仪合成仪合成仪合成仪合成合成整理ppt上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点优点缺点缺点鸟枪法鸟枪法反转录法反转录

14、法根据已知氨基根据已知氨基酸合成酸合成DNADNA法法操作简便操作简便广泛使用广泛使用工作量大，盲目，工作量大，盲目，分离出来的有时并分离出来的有时并非一个基因非一个基因专一性强专一性强操作过程麻烦，操作过程麻烦，mRNAmRNA很不稳定，要很不稳定，要求的技术条件较高求的技术条件较高专一性最强专一性最强仅限于合成核苷酸仅限于合成核苷酸对较少的简单基因对较少的简单基因整理ppt.如何从基因文库中找到所需要的基因？如何从基因文库中找到所需要的基因？ 从基因文库中找到目的基因是一件比较复杂从基因文库中找到目的基因是一件比较复杂的事情，要根据目的基因已有的某些信息来进的事情，要根据目的基因已有的某些

15、信息来进行。下面介绍一种根据基因的部分核苷酸序列行。下面介绍一种根据基因的部分核苷酸序列找到目的基因的方法。找到目的基因的方法。 第一步，通过第一步，通过PCR方法将目的基因已知的部方法将目的基因已知的部分核苷酸序列扩增出来，进行放射性同位素标分核苷酸序列扩增出来，进行放射性同位素标记（也可以用别的标记方法进行，如生物素、记（也可以用别的标记方法进行，如生物素、荧光素等），即用标记了放射性同位素的目的荧光素等），即用标记了放射性同位素的目的DNA片段作为探针，与扩增出来的片段作为探针，与扩增出来的DNA杂交。杂交。 整理ppt 第二步，将基因文库中的所有菌落转移至硝酸第二步，将基因文库中的所有

16、菌落转移至硝酸纤维膜上（也可以用其他类型的膜），然后，通过纤维膜上（也可以用其他类型的膜），然后，通过处理溶解消化掉细菌中的蛋白质，并使处理溶解消化掉细菌中的蛋白质，并使DNA固定在固定在膜上。膜上。 第三步，按第三步，按Southern (DNA与与DNA分子分子)杂交的方杂交的方法进行杂交。法进行杂交。 第四步，在第四步，在X光底片上出现黑斑的菌落，这表明光底片上出现黑斑的菌落，这表明这个菌落中含有所需要的目的基因（若选用别的标这个菌落中含有所需要的目的基因（若选用别的标记方法，有阳性信号的菌落则含有所需要的目的基记方法，有阳性信号的菌落则含有所需要的目的基因）。因）。 第五步，从该菌落中

17、再提取目的基因。第五步，从该菌落中再提取目的基因。整理ppt依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA 基因翻译产物蛋白质等特性基因翻译产物蛋白质等特性从基因文库中得到目的基因的方法从基因文库中得到目的基因的方法整理ppt 哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？整理ppt整理ppt整理ppt整理ppt高温高温变性变性中温中温延伸延伸低温低温复性复性整理ppt过程变性、退火、延伸、循环四步

18、曲1.变性：加热至9095双链DNA解链成为单链DNA2.退火：冷却至5560部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合（形成局部双链）3.延伸：加热至7075以目的基因为模板，合成互补的新DNA链4.循环拷贝：重复循环多次变性变性退火退火延伸延伸整理ppt 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、 _、_ (_ (做启动子做启动子) )、 _._.前提条件：前提条件：原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：聚合酶链式反应聚

19、合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列整理ppt聚合酶链式反应聚合酶链式反应整理ppt聚合酶链式反应聚合酶链式反应整理ppt5 5/ /3 3/ /G GG GT TC C3 3/ /5 5/ /G GA AC CC C聚焦二：目的基因的获取方法聚焦二：目的基因的获取方法 5 5/ /3 3/ /5 5/ /3 3/ /

20、整理ppt5 5/ /3 3/ /G GG GT TC C3 3/ /5 5/ /G GA AC CC C5 5/ /3 3/ /引物引物G GG G高温高温变性变性低温低温复性复性中温中温延伸延伸5 5/ /3 3/ /A AG G引物引物聚焦二：目的基因的获取方法聚焦二：目的基因的获取方法 5 5/ /3 3/ /5 5/ /3 3/ /整理ppt过程：过程：a a、DNADNA变性变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火复性、退火复性（55-6555-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与

21、DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，酶的作用下，合成与模板互补的合成与模板互补的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链整理ppt 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、 _、_ _ 、 _._.等等原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制

22、四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提条件）要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提条件）整理ppt过程：过程：a a、DNADNA变性（变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、复性复性（55-6555-65）：系统温度降低，引物与）：系统温度降低，引物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）

23、：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端延伸，合成与模板互补端延伸，合成与模板互补 的的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链整理pptTaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶 TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶 是从一种栖热水生菌是从一种栖热水生菌(Thermus(Thermusaquaticus)yT1aquaticus)yT1株分离提取的。株分离提取的。yTyT是是 一种嗜热真一种嗜热真细菌，能在细菌，能在70707575生长。该菌是生长。该菌是19691969年从美国年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的。该酶基因黄石国家森林公

24、园火山温泉中分离的。该酶基因全长全长24962496个碱基，编码个碱基，编码832832个氨基酸，酶蛋白分子个氨基酸，酶蛋白分子为为 94KDa94KDa。其比活性为。其比活性为200000200000单位单位/mg/mg。75758080时每个酶分子每秒钟可延伸约时每个酶分子每秒钟可延伸约150150个核苷个核苷 酸，酸，7070延伸率大于延伸率大于6060个核苷酸个核苷酸/ /秒，秒，5555时为时为2424个核个核苷酸苷酸/ /秒。温度过高秒。温度过高(90(90以上以上) ) 或过低或过低(22)(22)都都可影响可影响Taq DNATaq DNA聚合酶的活性，该酶虽然在聚合酶的活性，

25、该酶虽然在9090以以上几乎无上几乎无DNADNA合成，合成， 但确有良好的热稳定性，在但确有良好的热稳定性，在PCRPCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性。循环的高温条件下仍能保持较高的活性。整理ppt在在92.592.5、95 95 、97.597.5时，时，PCRPCR混合物混合物中的中的Taq DNATaq DNA聚合酶分别经聚合酶分别经130min130min，40min40min和和5 56min6min后，仍可后，仍可 保持保持50%50%的活性，实验表明，的活性，实验表明，PCRPCR反应时变性温度为反应时变性温度为959520sec20sec，5050个循环个循环后，后，T

26、aq DNATaq DNA聚合酶仍有聚合酶仍有65%65%的活性。的活性。Taq DNATaq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于聚合酶的热稳定性是该酶用于PCRPCR反应的前提反应的前提条件，也是条件，也是PCRPCR反应能迅速发展和广泛应用的反应能迅速发展和广泛应用的原因。原因。Taq DNATaq DNA聚合酶还具有逆转录活性，聚合酶还具有逆转录活性， 其其作用于类似逆转录酶作用于类似逆转录酶, ,此活性温度一般为此活性温度一般为65656868，有，有MnMn2+2+存在时，其逆转录活性更高。存在时，其逆转录活性更高。整理ppt整理ppt整理ppt整理pptPCRPCR技术技术DNADN

27、A复制复制过程过程DNADNA变性（变性（90909595）退火退火（复性（复性55556060）子链延伸子链延伸（70707575）重复循环重复循环DNADNA复制起始，复制起始，RNARNA引物形成引物形成DNADNA片段生成片段生成RNARNA引物水引物水解解完整的完整的DNADNA分子形成分子形成相同相同点点原则原则条件条件不同不同点点解旋解旋方式方式场所场所引物引物酶酶结果结果遵循碱基互补配对原则遵循碱基互补配对原则模板、原料、能量、酶、引物、温度等氢键在高温下断裂，双链全部解开解旋酶催化氢键逐步断裂，边解旋边复制体外体外主要在细胞核中主要在细胞核中DNADNARNA热稳定热稳定DN

28、ADNA聚合酶聚合酶（TaqTaq酶）酶）解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶、聚合酶、DNADNA连接酶等连接酶等在短时间内形成在短时间内形成大量的大量的DNADNA片段片段形成完整的DNA分子整理pptPCRPCR技术与技术与DNADNA复制的比较表复制的比较表PCR技术技术DNA复制复制相同点原理原理原料原料条件条件不同点解旋方解旋方式式场所场所酶酶结果结果碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸 模版、模版、ATP、酶、酶 DNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋 解旋酶催化解旋酶催化体外复制体外复制热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶(Taq酶酶)细胞核内细胞核内细胞内含有的细

29、胞内含有的DNA聚合酶聚合酶在短时间内形成大量的在短时间内形成大量的DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子整理ppt 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。的过程和不懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中（形成体质粒中（形成重组质粒重组质粒），然后导入棉花的），然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子启动子( (抗虫基因首端抗虫基因首

30、端) )，导入棉花受精卵，长成的棉，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动有启动子、抗虫基因的重组质粒子、抗虫基因的重组质粒中插入中插入终止子终止子( (抗虫抗虫基因末端基因末端) )，导入棉花受精卵，结果长成的植，导入棉花受精卵，结果长成的植株，有了抗虫能力。株，有了抗虫能力。 资 料整理ppt步骤二：表达载体的构建步骤二：表达载体的构建整理ppt基因表达载体构建过程基因表达载体构建过程整理ppt第二步、第二步、. .基因表达载体的构建：基因表达载体的构建：它们有什么作用？它们有什么作用？目的基因目的基因启动子启动子终止子终止子标记

31、基因标记基因复制原点复制原点标记基因标记基因整理ppt 位于基因的首端的一段特殊的位于基因的首端的一段特殊的DNADNA片断，片断，它是它是RNARNA聚合酶识别和结合的部位，有了聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录它才能驱动基因转录mRNAmRNA，最终获得蛋，最终获得蛋白质白质整理ppt 位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，片断， 能终止能终止mRNAmRNA的转录的转录标记基因标记基因是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来从而将有目的基因的细胞筛选出来整理ppt 基因工程载体的

32、构建需要考虑哪些方面的基因工程载体的构建需要考虑哪些方面的因素？道理何在？因素？道理何在？ 主要考虑以下几方面的因素。主要考虑以下几方面的因素。（1）基因的特点：如果一个来自动物的目的）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的基因的cDNA。基因的产物如果是一个糖蛋白，。基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白那么该基因在原核生物

33、细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无这些细胞器。细菌无这些细胞器。整理ppt（2）要选择强启动子或组织特异性启动子。）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。表达，就要选择种子中特异表达的启

34、动子。（3）要有选择标记基因，如抗生素基因，以）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。便选择出真正的转基因生物。整理ppt1.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。填空：基因表达载体的构建填空：基因表达载体的构建 核心核心3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限

35、制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同整理ppt质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒） 核心核心同一种同一种基因表达载体的构建基因表达载体的构建图解图解整理ppt想一想：其中有两个想一想：其中有两个DNA片段连接形成片段连接形成的的产物有几种？的的产物有几种？整理ppt注意载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构用到的工

36、具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。整理ppt 将所有将所有DNA直接导入受体细胞不是更直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？简便吗？如果这么做，结果会怎样？提示：有人采用总提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总化，即将一个生物中的总DNA提取出来，提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对没有进行表达载体

37、的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。格来讲不算基因工程。整理ppt步骤三：将目的基因导入受体细胞步骤三：将目的基因导入受体细胞 目的基因进入受体细胞内，并且在目的基因进入受体细胞内，并且在 受体细胞内维持稳定和表达的过程。受体细胞内维持稳定和表达的过程。整理ppt步骤三：将目的基因导入受体细胞步骤三：将目的基因导入受体细胞整理ppt整理ppt1目的基因导入植物细胞目的基因导入植物细胞（1 1）原理：）原理：农杆菌具有很强的趋化性，当植物体农杆菌具有

38、很强的趋化性，当植物体受损时，伤口处细胞分泌大量的酚类化合物，吸引农杆受损时，伤口处细胞分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，农杆菌中的菌移向这些细胞，农杆菌中的TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA转移至转移至受体细胞，并整个到染色体受体细胞，并整个到染色体DNADNA上。上。（2）受体细胞：）受体细胞：受精卵或体细胞受精卵或体细胞（3）适用范围：）适用范围： 双子叶植物或裸子植物双子叶植物或裸子植物原因：原因：农杆菌对大多数单子叶植物没有感染能力农杆菌对大多数单子叶植物没有感染能力整理ppt整理ppt整理ppt胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊整理ppt整理ppt 2 2

39、将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序：程序： 目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物整理ppt 3 3将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：方法： 用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表表达载体与感受态细胞混合达载体与感受态细胞混合 感受态感受态细胞吸收细胞吸收DNA分子分子整理ppt步骤四：目的基因的检测与鉴定步骤四：目的基因的检测与鉴定整理ppt 采用

40、一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。 整理ppt，整理pptDNA附着在膜上附着在膜上硝化纤维素硝化纤维素加探针加探针报告基因（含荧光素分子）报告基因（含荧光素分子）变性变性DNA杂交杂交（如检测（如检测SARS病毒等）病毒等）abcd整理ppt检测检测检

41、测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因方法方法DNADNA分子杂交分子杂交整理pptSouthern杂交杂交DNA和和DNA分子之间的杂交。目的分子之间的杂交。目的基因是否整合到受体生物的染色体基因是否整合到受体生物的染色体DNA中，这在真中，这在真核生物中是目的基因可否稳定存在和遗传的关键。核生物中是目的基因可否稳定存在和遗传的关键。如何证明这一点，就需要通过如何证明这一点，就需要通过Southern杂交技术。杂交技术。基本做法是：第一步，将受体生物基本做法是：第一步，将受体生物DNA提取出来，提取出来，经过适当的酶切后，走琼脂糖凝胶电

42、泳，将不同经过适当的酶切后，走琼脂糖凝胶电泳，将不同大小的片段分开；第二步，将凝胶上的大小的片段分开；第二步，将凝胶上的DNA片段转片段转移到硝酸纤维素膜上；第三步，用标记了放射性移到硝酸纤维素膜上；第三步，用标记了放射性同位素（或生物素）的目的同位素（或生物素）的目的DNA片段作为探针与硝片段作为探针与硝酸纤维素膜上的酸纤维素膜上的DNA进行杂交；第四步，将进行杂交；第四步，将X光底光底片压在硝酸纤维素膜上，在暗处使底片感光；第片压在硝酸纤维素膜上，在暗处使底片感光；第五步，将五步，将X光底片冲洗，如果在底片上出现黑色条光底片冲洗，如果在底片上出现黑色条带，则表明受体植物染色体带，则表明受体

43、植物染色体DNA上有目的基因。上有目的基因。整理pptDNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。 整理ppt检测检测检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA方法方法 分子杂交分子杂交（注意与上

44、不同之处）（注意与上不同之处）Northern杂交杂交DNA和和RNA分子之间的杂交。它分子之间的杂交。它是检测目的基因是否转录出是检测目的基因是否转录出mRNA的方法，具的方法，具体做法与体做法与Southern杂交相同，只是第一步从受杂交相同，只是第一步从受体植物中提取的是体植物中提取的是mRNA而不是而不是DNA，杂交带的，杂交带的显现也与显现也与Southern(DNA与与DNA)杂交相同。杂交相同。整理ppt检测检测检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质方法方法 抗原抗体杂交抗原抗体杂交整理pptWestern杂交杂交蛋白质分子（抗原蛋白质分子（抗原抗体）之间的杂抗

45、体）之间的杂交。它是检测目的基因是否表达出蛋白质的一种方法。交。它是检测目的基因是否表达出蛋白质的一种方法。具体做法是：具体做法是： 第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；第二步，将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生第二步，将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体（一抗）；相应的抗体，并提取出抗体（一抗）；第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳；第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳；第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上

46、的蛋白杂第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。由于这种抗原会特异结合。由于这种抗原抗体的结合显示不出条抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称为二抗的抗体，它可以与一抗结带，所以加入一种称为二抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特殊的标记。如果目的基因表达合，二抗抗体上带有特殊的标记。如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。出了蛋白质，则结果为阳性。整理ppt检测目的基因是否检测目的基因是否转录出了转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否检测目的基因是否翻译成蛋白质翻译成蛋

47、白质抗原抗体杂交抗原抗体杂交 用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNAmRNA杂交杂交, ,若出现若出现杂交带杂交带, ,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNAmRNA整理ppt个体个体生物学水平生物学水平抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等整理ppt思考与探究思考与探究 1.作为基因工程表达载体，只需含有作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？目的基因就可以完成任务吗？为什么？ 答：不可以。因为目的基因在表达载答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制条件

48、，如启动子、终止子和标记他控制条件，如启动子、终止子和标记基因等。基因等。整理ppt必须构建上述条件的主要理由是：必须构建上述条件的主要理由是：（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2） 通过通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；标记；（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往

49、还要为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控条件，如增强启动子等；增加一些其他调控条件，如增强启动子等；（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。因），如绿色荧光蛋白基因等。整理ppt 2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因能分析出农杆菌不能将目的基因

50、导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你应该如何做？理论上说，你应该如何做？ 整理ppt提示：农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在提示：农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因工程中以根瘤农杆菌的植物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中。转化最多。根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中。据不完全统计，约有据不完全统计，约有93属属643种双子叶植物对根瘤种双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。裸子植物对该菌也敏感。当这些植物农杆菌敏感。裸子植物对该菌也敏

51、感。当这些植物被该菌侵染后会诱发肿瘤。近年来，也有报道该菌被该菌侵染后会诱发肿瘤。近年来，也有报道该菌对单子叶植物也有侵染能力。对单子叶植物也有侵染能力。 整理ppt根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，

52、通常不存在于单子叶植物中，这细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来还发现一些中性糖，如近年来还发现一些中性糖，如L-阿拉伯糖、阿拉伯糖、D-木木糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既可以糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中Ti质粒上质粒上Vir区（毒性区）基因的诱导物，使区（毒性区）基因的诱导物，使Vir区基因活化，导致区基因活化，导致T-DNA的加工和转移，从而侵的加工和转移，从而侵染植物细胞。染植物细胞。整理

53、ppt需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力有需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力有差别，在基因工程中需要加以选择使用。利用农差别，在基因工程中需要加以选择使用。利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，农上述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：要选择合适的农杆菌菌杆菌，但要注意两点：要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所

54、有的农杆菌菌株都可以侵染单子株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）区（诱导）的基因，使的基因，使T-DNA转移并插入到染色体转移并插入到染色体DNA上。上。整理ppt农杆菌主要有两种：根癌农杆菌农杆菌主要有两种：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。）。根癌农杆菌根癌农杆菌能能在自然条件下趋化性地感染在自然条件下趋化性地感染140多种多种双子叶植物双子叶植物或或裸子植物裸子植物的受伤部位，并诱导产生的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤冠瘿瘤。引发冠瘿瘤的原因是，引发