组化和免疫组化染色结果的定量测定

1、组化和免疫组化染色结果的定量测定2I. 图像分析术图像分析术A. 目测半定量目测半定量: 依据反应产物的面积和颜色深浅依据反应产物的面积和颜色深浅, 主观性大主观性大.B. 图像分析仪图像分析仪(Image analyzer): 又称图像分析系统又称图像分析系统. 1. 主要结构和工作原理主要结构和工作原理:a. 显微镜显微镜: 获取染色结果的光学信息获取染色结果的光学信息.b. 图像输入装置图像输入装置: 摄像机或扫描器摄像机或扫描器, 将光学信息输入电脑将光学信息输入电脑. c. 电脑电脑: 将光学信息转换成电子信息将光学信息转换成电子信息. 将光学信号的灰度分为将光学信号的灰度分为256

2、级可发现染色深浅的微小差别级可发现染色深浅的微小差别. 彩色有两种彩色有两种: 真彩色真彩色(Real color) 是指标本染色的真实颜色是指标本染色的真实颜色, 而假彩色而假彩色(Pseudo color)是指是指将不同灰度转换成不同的颜色以增强对比度将不同灰度转换成不同的颜色以增强对比度.d. 输出装置输出装置: 显示器或打印机等给出图象表面几何形状测量显示器或打印机等给出图象表面几何形状测量(体积体积/面积面积/表面积表面积/)和图象密度测量和图象密度测量(数目数目)等客观数据等客观数据. 32. 应用应用: 定量给出组织细定量给出组织细胞形态的几何参数和组织胞形态的几何参数和组织结构

3、结构(包括宏观和微观包括宏观和微观)的的特征性参数特征性参数, 从平面测量从平面测量推算到空间参数和组织结推算到空间参数和组织结构的三维图像重建构的三维图像重建. 3. 注意事项注意事项:a. 照片高质量高倍照片高质量高倍. 对照对照组照片的放大倍数应相同组照片的放大倍数应相同.b. 复染会影响灰度值的准复染会影响灰度值的准确性确性.c. 必要时要进行图像的加工处理必要时要进行图像的加工处理, 如阳性区选择和图像切割如阳性区选择和图像切割等等.4左侧睾丸和附睾体部精子结合抗原蛋白异构体左侧睾丸和附睾体部精子结合抗原蛋白异构体 11 (SPAG11E)免疫组化染色免疫组化染色. 西安交通大学医学

4、院解剖与组胚专业博士生田宏西安交通大学医学院解剖与组胚专业博士生田宏. 2010.左侧睾丸左侧睾丸: A. 左侧假手术对照组左侧假手术对照组; B. 精索静脉曲张精索静脉曲张(ELV) 2周组周周组周; C. ELV4周周. 附睾体部附睾体部: D. 左侧假手术对照组左侧假手术对照组; E. ELV2周周; F. ELV4周周. 5ELV大鼠睾丸和附睾大鼠睾丸和附睾SPAG11E免疫组化灰度值测定结果免疫组化灰度值测定结果: 睾丸睾丸: ELV 2周和周和4周组周组SPAG11E蛋白的平均灰度值与其相应的对照组蛋白的平均灰度值与其相应的对照组比较未见明显改变比较未见明显改变(P0. 05);

5、附睾附睾: ELV2周和周和 4周组周组SPAG11E蛋白的表达均较同期对照组显著减弱蛋白的表达均较同期对照组显著减弱(P0. 05或或P0. 01), ELV4周组附睾周组附睾SPAG11E蛋白的表达较蛋白的表达较ELV2周组显著周组显著减弱减弱(P0. 01). 6II. 显微分光光度术显微分光光度术A. 简介简介: 细胞分光光度计细胞分光光度计(cytospectrophotometer), 是一种是一种以物质分子对光波的选择性吸收为基础以物质分子对光波的选择性吸收为基础, 对生物样品中对生物样品中的化学物质进行定量测定的精密仪器的化学物质进行定量测定的精密仪器. 通过测定核酸通过测定核

6、酸, 蛋蛋白质白质, 脂类脂类, 酶类或其它化学成分的光吸收和微区面积而酶类或其它化学成分的光吸收和微区面积而计算它们的相对含量计算它们的相对含量. B. 主要结构和工作原理主要结构和工作原理: 1. 光源光源: 有白炽灯和汞灯有白炽灯和汞灯, 疝灯疝灯. 白炽灯可作为标准光源白炽灯可作为标准光源, 辐射光谱在辐射光谱在400700nm间间, 用于一般测量用于一般测量. 汞灯为激发荧光汞灯为激发荧光的理想光源的理想光源, 疝灯的辐射光谱在疝灯的辐射光谱在2501100nm间间. 2. 单色器和滤光片单色器和滤光片: 保证进入显微镜的光波亮度充足保证进入显微镜的光波亮度充足, 波波长单一且可调长

7、单一且可调. 3. 光电组合件光电组合件: 将测量区内的光学信号转变为电子信号将测量区内的光学信号转变为电子信号, 产生测量数据产生测量数据.7C. 基本步骤基本步骤:1. 标本制备标本制备: 凡是显示细胞内化学物质的各种组化和免疫组凡是显示细胞内化学物质的各种组化和免疫组化染色标本均可用显微分光光度计对单个细胞进行定量测化染色标本均可用显微分光光度计对单个细胞进行定量测定定, 但标本内不能有双重染色且染色要保持均匀一致但标本内不能有双重染色且染色要保持均匀一致. 82. 测量方法测量方法: a. 单波长法单波长法: 用一种波长的光测量用一种波长的光测量, 所测物质分布如果是均所测物质分布如果

8、是均匀的匀的, 因此测量法所得数值因此测量法所得数值, 其误差就小其误差就小. b. 扫描测量法扫描测量法: 能够消除由于吸光物质分布不均匀而造成的能够消除由于吸光物质分布不均匀而造成的分布误差分布误差, 和由于面积不规则造成的面积测量误差和由于面积不规则造成的面积测量误差. 扫描法扫描法的原理是通过积分的方法的原理是通过积分的方法, 虽然被测物质分布不均匀虽然被测物质分布不均匀, 但可但可以将被测物质的面积分成许多小区以将被测物质的面积分成许多小区, 将各个小区的数值相加将各个小区的数值相加. c. 荧光光度法荧光光度法: 凡被测物质能产生荧光凡被测物质能产生荧光(原发荧光原发荧光, 诱发荧

9、光诱发荧光, 荧光或免疫荧光标记荧光或免疫荧光标记)的都可以应用荧光光度法测定的都可以应用荧光光度法测定. 广泛用广泛用于测定细胞内的核酸于测定细胞内的核酸(DNA和和RNA), 氨基酸氨基酸, 蛋白质蛋白质, 糖原糖原, 生生物胺物胺, 抗体和酶的相对含量抗体和酶的相对含量. D. 应用范围应用范围: 对细胞的对细胞的DNA, RNA, 蛋白质蛋白质, 酶酶, 糖糖, 脂等大分脂等大分子物质以及免疫活性物质等都能定性子物质以及免疫活性物质等都能定性, 定位和定量测定定位和定量测定. 9III. 流式细胞术流式细胞术A. 简介简介: 可对单个细胞逐个地进行高速准确的定量分析和分可对单个细胞逐个

10、地进行高速准确的定量分析和分类类, 每秒测定达数千万个细胞每秒测定达数千万个细胞, 且有高度的重复性且有高度的重复性. 在单个在单个细胞中细胞中, 可同时测得可同时测得DNA, RNA及细胞体积及细胞体积3个参数个参数, 也可测也可测定核与细胞的比例定核与细胞的比例, 蛋白质和免疫标记的其它参量蛋白质和免疫标记的其它参量. B. 主要结构和工作原理主要结构和工作原理: 1. 液流系统液流系统: 先制备荧光等染色的单细胞悬液先制备荧光等染色的单细胞悬液, 放入样品管放入样品管中中, 使其在气体压力下进入流动室使其在气体压力下进入流动室; 流动室内充满鞘液流动室内充满鞘液, 在在鞘液的约束下鞘液的

11、约束下, 细胞排列成单行细胞排列成单行, 由流动室的喷嘴喷出由流动室的喷嘴喷出, 成成为细胞柱液为细胞柱液, 依次恒速通过测量区依次恒速通过测量区. 2. 激发光器件激发光器件: 在测量区内发射波长可调的激光柱在测量区内发射波长可调的激光柱, 垂直照垂直照射细胞液柱射细胞液柱, 细胞受激光照射后发生散射光和荧光细胞受激光照射后发生散射光和荧光. 103. 信号检测系统信号检测系统: 测定细胞发出荧光的角度测定细胞发出荧光的角度, 波长和大小波长和大小, 可知细胞的体积和细胞内某种物质的含量可知细胞的体积和细胞内某种物质的含量. 4. 控制系统控制系统: 校准调节上述系统校准调节上述系统. 11

12、C. 样品染色样品染色: 绝大多数用荧光染料进行标记绝大多数用荧光染料进行标记.1. DNA含量含量: 溴化乙啶溴化乙啶(EB)和碘化丙啶和碘化丙啶(PI)嵌插入嵌插入DNA的的双螺旋双螺旋; 神光霉素与神光霉素与G-C有特异性有特异性; Hoechst33258与与A-T有有特异性特异性; 吖啶橙吖啶橙(Acridine orange, AO)可以同时染色可以同时染色DNA和和RNA. 2. 细胞核细胞核: DAPI (4, 6-二脒基二脒基-2-苯基吲哚苯基吲哚 )是专与细胞核是专与细胞核结合的荧光素结合的荧光素.3. 蛋白质含量蛋白质含量: 一般用异硫氰酸荧光素一般用异硫氰酸荧光素(FI

13、TC). 4. 外周外周T, B和单核细胞以及和单核细胞以及T细胞的亚群分选细胞的亚群分选: 结合特结合特异性单克隆抗体异性单克隆抗体. 12D. 应用举例应用举例: 1. 肿瘤学肿瘤学(Oncology): 绝大多数肿瘤从空间与时间上都显示绝大多数肿瘤从空间与时间上都显示出稳定的多倍体出稳定的多倍体DNA含量含量, 而且常常是非整倍体数而且常常是非整倍体数. FCM能能诊断异常的诊断异常的DNA干系干系, 可作为指导肿瘤的治疗可作为指导肿瘤的治疗, 了解病情了解病情发展发展, 判断预后和肿瘤治疗药物筛选等的有力证据判断预后和肿瘤治疗药物筛选等的有力证据. 2. 细胞凋亡细胞凋亡(Apopto

14、sis): 细胞凋亡是细胞程序性死亡细胞凋亡是细胞程序性死亡, 其特其特征是染色体断裂和征是染色体断裂和DNA片段化片段化, 凝胶电泳呈现梯状条带凝胶电泳呈现梯状条带; 细胞皱缩细胞皱缩, 致密并迅速破碎形成凋亡小体致密并迅速破碎形成凋亡小体, 而被邻近细胞而被邻近细胞所吞噬所吞噬. 细胞凋亡时需要继续合成细胞凋亡时需要继续合成DNA, 蛋白质和蛋白质和ATP. FCM检测分析可见检测分析可见DNA G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰峰前出现一个亚二倍体峰(又称亚又称亚G1峰峰), 代表细胞凋亡代表细胞凋亡, 该峰下的面积即是凋亡细胞的相对该峰下的面积即是凋亡细胞的相对数量数量, 可由可由FCM

15、自动给出自动给出. 13FCM检测检测HL-60细胞凋亡细胞凋亡. 西安交通西安交通大学医学院人体解剖与组胚专业博大学医学院人体解剖与组胚专业博士生杜宝玲士生杜宝玲, 2005.A图中可见明显的亚图中可见明显的亚G1峰峰(25.9%), 提提示细胞凋亡示细胞凋亡. B图和图和C图显示两种图显示两种Caspase-3反义寡反义寡核苷酸转染干扰后核苷酸转染干扰后, 亚亚G1峰消失峰消失.14IV. 激光扫描共聚焦显微镜术激光扫描共聚焦显微镜术A. 简介简介: 以激光和计算机技术为以激光和计算机技术为基础把普通基础把普通LM和荧光和荧光LM功能相功能相结合结合, 用激光扫描进行用激光扫描进行“光学切

16、光学切片片”, 显微镜进行微观检测显微镜进行微观检测, 计计算机对资料高速实时存储和分析算机对资料高速实时存储和分析, 将形态学的定量观察将形态学的定量观察, 生理学的生理学的动态检测和生物化学的定量分析动态检测和生物化学的定量分析融为一体融为一体, 从而使对被检物体的从而使对被检物体的表面表面, 单层单层, 静态静态, 局部的观察局部的观察进展到立体进展到立体, 断层扫描断层扫描, 动态动态, 全面的观察全面的观察. 15B. 特点特点:1. 分辨率高分辨率高: LSCM以激光为光源以激光为光源, 观察标本的反差明显观察标本的反差明显, 最最小可观察厚度为小可观察厚度为 m. 2. 灵敏度高

17、灵敏度高: 采用光电倍增管来检测荧光采用光电倍增管来检测荧光, 并利用不同的滤并利用不同的滤片可将不同的光分开片可将不同的光分开. 3. 扫描速度快扫描速度快: 可达微秒级可达微秒级. 因此可动态观察细胞内化学成因此可动态观察细胞内化学成分如分如Ca2+, Mg2+和和pH值的变化值的变化, 也可对膜电位也可对膜电位, 膜的流动性等膜的流动性等进行测定进行测定. 4. 光学切片与细胞光学切片与细胞CT : 将样品各深度的切片叠加在一起进行将样品各深度的切片叠加在一起进行三维重组三维重组, 观察不同断面中细胞成分的变化观察不同断面中细胞成分的变化, 即即“细胞细胞CT”. 5. 图像存取方便图像

18、存取方便: 计算机可快速及时保存图像计算机可快速及时保存图像, 其数据存取其数据存取方便方便, 可随时调用可随时调用. 16C. 功能功能:1. 静态观察静态观察:a. 单染色样品的观察和分析单染色样品的观察和分析: 可对一种荧光标记的样品进可对一种荧光标记的样品进行观察和分析行观察和分析, 获得细胞平均荧光强度获得细胞平均荧光强度, 积分荧光强度积分荧光强度, 细胞的周长细胞的周长, 截面积和形态因子等参数截面积和形态因子等参数. b. 双染色样品的观察和分析双染色样品的观察和分析: 可将同一部位的不同扫描图可将同一部位的不同扫描图像叠加起来像叠加起来, 用于双染用于双染, 三染甚至四染样品

19、三染甚至四染样品, 但需注意各但需注意各种荧光染料的激发和发射波长互不干扰种荧光染料的激发和发射波长互不干扰. c. 自动图像扫描观察分析自动图像扫描观察分析: 用于一个平皿中多个散在并可用于一个平皿中多个散在并可能同时发生变化的细胞的同时观察能同时发生变化的细胞的同时观察.d. 荧光强度的定量测定荧光强度的定量测定: 用于高灵敏度快速的免疫荧光测用于高灵敏度快速的免疫荧光测定定, 以准确地监测抗原表达以准确地监测抗原表达, 细胞结合和杀伤及定量的形细胞结合和杀伤及定量的形态学特性态学特性.172. 动态观察动态观察: a. 细胞内各种离子浓度的测定细胞内各种离子浓度的测定: 用于动态观察一段

20、时间内用于动态观察一段时间内细胞内细胞内Ca2+, Mg2+, pH值的变化并可进行定量测定值的变化并可进行定量测定. 其点扫其点扫描描, 线扫描和图像扫描可分别观察微秒级和毫秒级的快速线扫描和图像扫描可分别观察微秒级和毫秒级的快速变化变化. b. 细胞膜流动性测定细胞膜流动性测定: 细胞膜荧光探针受到极化光线激发细胞膜荧光探针受到极化光线激发后后, 其发射光的极性依赖于荧光分子的旋转其发射光的极性依赖于荧光分子的旋转, 而这种有序而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围的膜流动性的运动自由度依赖于荧光分子周围的膜流动性. 183. 生物活性物质笼锁生物活性物质笼锁(Caged)和解笼锁和解笼

21、锁(Uncaged)的测定的测定: 笼笼锁化合物与生物活性物质锁化合物与生物活性物质(如第二信使如第二信使, 核苷酸核苷酸, 神经递神经递质质, Ca2+等等)结合可抑制后者的活性结合可抑制后者的活性, 使其处于笼锁状态使其处于笼锁状态. 当用当用LSCM强度和时间可人为控制的特异性波长的光瞬间强度和时间可人为控制的特异性波长的光瞬间照射后照射后, 光活化解笼锁光活化解笼锁, 使该活性物质释放使该活性物质释放, 其直接在光其直接在光解部位发挥的作用为解部位发挥的作用为LSCM所检测所检测. 4. 贴壁细胞的分选贴壁细胞的分选: 用高能量激光杀灭不需要的细胞用高能量激光杀灭不需要的细胞(荧荧光标

22、记光标记), 留下需要的活细胞继续培养留下需要的活细胞继续培养.195. 荧光光漂白恢复荧光光漂白恢复(Fluorescence recovery after photobleach, FRAP): 用来测定活细胞的动力学参数用来测定活细胞的动力学参数. FRAP借助高强度脉冲借助高强度脉冲激光来照射细胞某一区域激光来照射细胞某一区域, 造成该区域荧光分子的光粹灭造成该区域荧光分子的光粹灭, 该该区域周围的非粹灭荧光分子会以一定的速率向受照射区域扩区域周围的非粹灭荧光分子会以一定的速率向受照射区域扩散散, 这个扩散速率可通过这个扩散速率可通过LSCM探测探测, 得到分子运动和胞间通得到分子运动

23、和胞间通讯等动力学参数讯等动力学参数.6. 激光光陷阱技术激光光陷阱技术: 即光摄技术即光摄技术, 广泛应用于染色体移动广泛应用于染色体移动, 细细胞器移动胞器移动, 细胞骨架弹性测量细胞骨架弹性测量, 细胞周期和调控研究及分子动细胞周期和调控研究及分子动力原研究等力原研究等. 利用光学梯度力形成的光陷阱利用光学梯度力形成的光陷阱, 产生具有传统机产生具有传统机械挟持和操纵微小物体的功能械挟持和操纵微小物体的功能. 当微米级颗粒落入一个非均匀当微米级颗粒落入一个非均匀光场中光场中, 它将趋于特定的平衡位置它将趋于特定的平衡位置, 物体不会偏离光学中心物体不会偏离光学中心, 造成一个势能较低的陷阱区域造成一个势能较低的陷阱区域, 这种固定是光子动量的结果这种固定是光子动量的结果, 与照明强度和波长有关与照明强度和波长有关. 20Overlapping distributions of corticothalamic (皮质丘脑皮质丘脑) and (丘脑丘脑皮层皮层) thalamocortical pathways. Early postnatal mouse.GABA-containing terminals (red) in close apposition to oxytocin neurons