上海交通大学微生物实验课件实验八质粒提取

1、实验八质粒提取、病毒培养质粒提取、病毒培养实验目的理解碱裂解法制备质粒DNA的原理掌握提取质粒DNA的方法掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理掌握DNA电泳操作及DNA分子量大小的测定一、质粒的一般生物学特性一、质粒的一般生物学特性 质粒质粒(plasmid)是独立于细菌染色体以外的能自我是独立于细菌染色体以外的能自我复制的环状闭合的双股复制的环状闭合的双股DNA，质粒，质粒DNA一般为细一般为细菌染色体的菌染色体的3%左右左右, 作为基因克隆质粒载体的所有作为基因克隆质粒载体的所有质粒质粒DNA分子都必定包括如下三个共同的组成部分子都必定包括如下三个共同的组成部分分: 复制基因、选择标志基因和克隆

2、位点。复制基因、选择标志基因和克隆位点。 质粒广泛存在于细菌细胞中质粒广泛存在于细菌细胞中, 此外在霉菌、蓝藻、此外在霉菌、蓝藻、酵母和某些动植物细胞中也发现有质粒存在。酵母和某些动植物细胞中也发现有质粒存在。 大肠杆菌乳糖操纵子简介： I: 调节基因 P: 启动子 O: 操纵基因 Z、Y、A: 结构基因, 其中Z编码 -半乳糖甘酶( -galactosidase), Y 编码透性酶 ( permease) , A 编码乙酰基转移酶( acetylase).IPOZYAOri:复制子：multiple cloning sites,多克隆位点二、碱裂解法制备质粒DNA注意点：使用酚氯仿时注意安全

3、三、琼脂糖凝胶电泳技术（Agarose gel electroghoresis）注意点：制、看胶时，戴一次性手套，注意注意点：制、看胶时，戴一次性手套，注意（溴化乙錠）（溴化乙錠）碱裂解法制备质粒DNA（书上的原理不完全正确）染色体染色体DNADNA分子大，易断裂乘线型分子大，易断裂乘线型DNADNA分子分子质粒质粒DNA DNA 共价闭合环型共价闭合环型在碱性环境中线型的染色体在碱性环境中线型的染色体DNADNA和环型的质粒和环型的质粒DNADNA氢键发生断裂，氢键发生断裂，双链解开而变性，但质粒双链解开而变性，但质粒DNADNA只部分发生断裂，两条互补链不只部分发生断裂，两条互补链不会完全

4、分离。会完全分离。当当pHpH调至中性并在高盐浓度存在的条件下，已分开的染色体调至中性并在高盐浓度存在的条件下，已分开的染色体DNADNA互补链不能复性，交联形成不溶性网状结构，通过离心，互补链不能复性，交联形成不溶性网状结构，通过离心，大部分染色体大部分染色体DNADNA、不稳定的大分子、不稳定的大分子RNARNA和蛋白质和蛋白质SDSSDS复合物复合物等一起沉淀下来。等一起沉淀下来。部分变性的质粒部分变性的质粒DNADNA在中性环境中很快复性，呈可溶状态保存在中性环境中很快复性，呈可溶状态保存在溶液中，离心后，存在上清中。在溶液中，离心后，存在上清中。再通过酚、氯仿、乙醇沉淀，获得纯的再通

5、过酚、氯仿、乙醇沉淀，获得纯的DNADNA溶液溶液I I，50 mM50 mM葡萄糖葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA10 mM EDTA，pH 8.0pH 8.0；溶液溶液IIII，0.2 N NaOH / 1% SDS0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液溶液IIIIII，3 M 3 M 醋酸钾醋酸钾 / 2 M / 2 M 醋酸；醋酸；溶液溶液：酚：氯仿：异丙醇：酚：氯仿：异丙醇2525：2424：1 1所用溶液所用溶液质粒的提取 p143（1）新鲜培养含有质粒的细菌（2）取1ml 培养物加入1.5ml离心管中，10

6、000rpm离心2 min。（3）倒掉上清，尽可能倒干净。（4）细菌沉淀重悬于100ul100ul的溶液的溶液中，用 移液枪吹打至均匀。须确使细菌沉淀在溶液中完全分散(三种成分各发挥什么作用？）。操作程序（5）加200l200l新配制的溶液新配制的溶液（问什么现配现用？怎样发（问什么现配现用？怎样发挥作用的？严格控制时间，为什么？）挥作用的？严格控制时间，为什么？）盖紧管口，颠倒离心管几次（不要振荡），以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液接触。于室温放置-3分钟至液体清亮。（6）加加150l150l的溶液的溶液 (2(2种成分发挥怎样的作用？仔细观种成分发挥怎样的作用？仔细观察，发生

7、了什么现象？）察，发生了什么现象？）盖紧管口，颠倒离心管几次（不要振荡），以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液接触。（7）410000rpm410000rpm离心离心1010分种分种，立即将上清（400-450l）转移到另一离心管中。不要带入沉淀，如有则用枪头挑出。操作程序（8）加等体积的溶液加等体积的溶液，振荡、颠倒离心管几次以沉淀DNA，于室温放置分钟，小心吸取上层水相上层水相至另一洁净的离心管中（为什么要用这（为什么要用这3 3种试剂？）种试剂？）。（9）加入2 2倍体积倍体积的冷的无水乙醇，室温放置分钟，10000rpm 5min，在管底可见微量的DNA沉淀，小心吸弃上清液。

8、（10）加入1ml70%1ml70%乙醇乙醇，将DNA沉淀悬浮起来后，410000rpm离心分钟。（11）小心吸弃上清液，将离心管倒置于一张纸巾上以吸尽液体。在室温干燥室温干燥1010分钟分钟。（12）取30l灭菌水，用枪头吹达沉淀，使其彻底溶解，取9l9l的的DNADNA样品样品进行琼脂糖电泳，其余-20保存备用。电泳准备用透明胶封固玻璃板两头，在板一端放置电泳梳子。用1TAEbuffer配制琼脂糖凝胶(0.24g Agaros/32ml 1TAEbuffer)，在微波炉中加热至琼脂糖溶解。待溶液冷却至60，加入适量溴化乙锭至微红，混匀。将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度在5-7mm之间

9、。在凝胶完全凝固后，撕去透明胶，小心地将玻璃板移至装有1TAEbuffer的电泳槽中，轻轻地拔去梳子，且使缓冲液没过胶面。DNA电泳取9l的DNA样品与1l的10*样品缓冲液混合后，用微量取样器慢慢将混合物加至样品孔中。盖上电泳槽并通电，使DNA向阳极移动。当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离（根据DNA的大小、1kb和3kb左右的指示剂来判断）后，切断电源，取出玻璃板，在紫外灯下观察，并拍照记录结果，估测质粒分子量的大小。实验要求每组同学看到质粒条带每组同学看到质粒条带估算出质粒条带的分子量大小估算出质粒条带的分子量大小实验报告实验目的实验目的实验原理实验原理实验步骤实验步骤结果与分析结果与分析思考

10、题思考题P145 P145 （1 1），）， （2 2），）， （3 3）下次实验下次实验病毒的培养（鸡胚接种）病毒的培养（鸡胚接种）病毒的分离与培养病毒的分离与培养实验目的理解常规的病毒培养的基本方法掌握利用鸡胚培养病毒的原理掌握鸡胚接种的基本路径学会鸡胚的鉴别病毒的种类专性活细胞寄生专性活细胞寄生动物病毒动物病毒l鸡胚接种鸡胚接种l细胞培养细胞培养植物病毒植物病毒细菌病毒细菌病毒从病料中分离病毒从病料中分离病毒一、样本的采集与处理一、样本的采集与处理1 1、一般原则：、一般原则： 合适的时间，合适的病变部位，合适合适的时间，合适的病变部位，合适的处理和保存方法的处理和保存方法 一般都要一般

11、都要44保存保存2 2、病料的种类、病料的种类动物样本：动物样本：（1）心、肝、肺、脾、肾脏和淋巴结等实质性器官（2）各种液体病料 （3）肠内容物和肠壁（4）皮肤病料 （5）骨 （6）脑、脊髓 植物样本：植物样本： 发病植株的根、茎、叶、花、果等；采集病料应具有针对性：在采集病料时应有重点地采采集病料应具有针对性：在采集病料时应有重点地采集有关脏器、内容物、分泌物、排泄物或其他材料。集有关脏器、内容物、分泌物、排泄物或其他材料。在无法估计病因时，可全面采集病料。进行流行病学在无法估计病因时，可全面采集病料。进行流行病学调查、抗体检测、群体健康评估或环境卫生检测时，调查、抗体检测、群体健康评估或

12、环境卫生检测时，样品的采集数量不能太少，应具统计学意义。样品的采集数量不能太少，应具统计学意义。B. B. 无菌采样：采集所用的器械、样品管等均应消毒灭菌，无菌采样：采集所用的器械、样品管等均应消毒灭菌，采集过程应保持无菌操作，不同个体、不同组织样品采集过程应保持无菌操作，不同个体、不同组织样品应作好标。应作好标。C. C. 采集新鲜病料：动物发病后应立即采集病料，否则，采集新鲜病料：动物发病后应立即采集病料，否则，尸体腐败会影响采样和检测效果，特别是用于病理学尸体腐败会影响采样和检测效果，特别是用于病理学检查的病料更应及时采集。检查的病料更应及时采集。3、送检病料样本的标记送检病料样本的标记

13、（1 1）送检病料的物种、年龄、性别、发病日期、）送检病料的物种、年龄、性别、发病日期、死亡时间等。死亡时间等。（2 2）流行病学、临床表现、病理剖检等等初步诊）流行病学、临床表现、病理剖检等等初步诊断材料。断材料。（3 3）免疫接种和用药治疗情况。）免疫接种和用药治疗情况。（4 4）病料中是否加有一些特殊的保护剂。）病料中是否加有一些特殊的保护剂。（5 5）送检的目的和要求。）送检的目的和要求。（6 6）姓名和联系方式。）姓名和联系方式。4 4、待检病毒材料的处理：、待检病毒材料的处理：（1 1）组织材料需经剪碎、研磨后，以汉克氏液作）组织材料需经剪碎、研磨后，以汉克氏液作1 1：1010稀

14、释，每毫升加入青、链霉素各稀释，每毫升加入青、链霉素各1000IU1000IU，再反复冻融，再反复冻融3 3次，使病毒从细胞中释放出来，次，使病毒从细胞中释放出来，3000-40003000-4000转转/ /分钟分钟离心离心2020分钟，取上清液微孔滤膜过滤后作为接种物。分钟，取上清液微孔滤膜过滤后作为接种物。（2 2）分泌物、粪便等材料则可直接以汉克氏液作）分泌物、粪便等材料则可直接以汉克氏液作1 1：1010稀释，每毫升加入青、链霉素各稀释，每毫升加入青、链霉素各1000IU1000IU，44放置过放置过夜，夜，3000-40003000-4000转转/ /分钟离心分钟离心2020分钟，

15、取上清液作为接分钟，取上清液作为接种物。种物。（3 3）接种物在接种前需做细菌培养试验，只有无菌接）接种物在接种前需做细菌培养试验，只有无菌接种物才可进一步使用。种物才可进一步使用。（4 4）植物样本经剪碎、研磨、离心、过滤后接种植株）植物样本经剪碎、研磨、离心、过滤后接种植株鸡胚接种基本原理鸡胚培养的优点：鸡胚培养的优点：鸡胚作为病毒的敏感细胞，能支持病毒完成鸡胚作为病毒的敏感细胞，能支持病毒完成从吸附到基因组复制，转录，蛋白质合成，从吸附到基因组复制，转录，蛋白质合成，装配，裂解的整个生命过程，从而使得病毒装配，裂解的整个生命过程，从而使得病毒得以繁殖。得以繁殖。接种路径：羊膜腔，尿囊腔，

16、绒毛尿囊膜，接种路径：羊膜腔，尿囊腔，绒毛尿囊膜，胚体和卵黄囊接种等胚体和卵黄囊接种等不同的病毒必须采用不同的接种路径不同的病毒必须采用不同的接种路径鸡胚培养病毒的用途：分离，繁殖，毒力测鸡胚培养病毒的用途：分离，繁殖，毒力测定，疫苗制备等定，疫苗制备等动物病毒实验动物鸡胚多种细胞培养接种前的准备鸡胚的孵化鸡胚的孵化鸡胚的活力鉴别鸡胚的活力鉴别样本的前处理样本的前处理确定采用的接种路径确定采用的接种路径实验步骤 p1031 1、照蛋：、照蛋：活胚：有鲜红的血管、摇动有黑点、黑点运动活胚：有鲜红的血管、摇动有黑点、黑点运动灵活。灵活。死胚：血管比较暗、摇动时黑点运动不灵活死胚：血管比较暗、摇动时黑点运动不灵活无精蛋：均匀透明、无血管和黑点无精蛋：均匀透明、无血管和黑点2 2、划出气室、划出气室 找出血管相对较少的部位找出血管相对较少的部位3 3、消毒气室、消毒气室 先用碘酊棉球，在用酒精棉球脱碘先用碘酊棉球，在用酒精棉球脱碘4 4、打孔器打孔、打孔器打孔 在气室的斜上方中心在气室的斜上方中心5 5、病毒接种、病毒接种 灭菌注射器取灭菌注射器取0.20.2毫升病毒液（毫升病毒液（鸡新城鸡新城疫病毒疫病毒），沿孔垂直插入约），沿孔垂直插入约1.51.5厘米进行厘米进行接种（接种（尿囊腔接种尿囊腔接种）6 6、石蜡封闭接种孔、石蜡封闭接种孔（石蜡加热时温度不要（石蜡加热时温度不