细胞生物学实验课-3-细胞传代与冻存

1、细胞生物学实验 张 伟 实验三、细胞的传代培养与冻存实验三、细胞的传代培养与冻存细胞生物学实验 张 伟l1. 1.细胞培养中为什么细胞培养中为什么NaHCONaHCO3 3？l2.2.细胞培养中为什么添加血清？细胞培养中为什么添加血清？l3.3.消化液胰酶的浓度是多少？消化液胰酶的浓度是多少？细胞生物学实验 张 伟一、实验原理一、实验原理（一）传代培养（一）传代培养 1. 1.传代培养的概念传代培养的概念 当原代培养细胞或已成为细胞系的细当原代培养细胞或已成为细胞系的细胞，增殖达到一定密度后，将培养的细胞胞，增殖达到一定密度后，将培养的细胞从一个容器以适当比率转移到另一个或几从一个容器以适当比

2、率转移到另一个或几个容器中扩大培养，称为传代培养或继代个容器中扩大培养，称为传代培养或继代培养。培养。细胞生物学实验 张 伟2. 2. 细胞传代的意义与目的细胞传代的意义与目的 防止细胞增殖过度、营养枯竭、酸中毒防止细胞增殖过度、营养枯竭、酸中毒 维持细胞种的维持细胞种的延续延续。 利用培养细胞利用培养细胞进行各种实验进行各种实验。细胞生物学实验 张 伟n传代中的传代中的 “代代”与细胞世代中的与细胞世代中的 “代代”不同不同n传代的频率或间隔与培养液的性质、接传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖速度有关。种细胞的数量和细胞增殖速度有关。 3. 3. 需要注意的两个问题需要

3、注意的两个问题细胞生物学实验 张 伟（二）培养细胞的种类二）培养细胞的种类贴壁细胞贴壁细胞：附着在一个固相支持物表面才附着在一个固相支持物表面才能生长的细胞。如大部分的上皮来源的细能生长的细胞。如大部分的上皮来源的细胞。单层细胞，接触抑制。胞。单层细胞，接触抑制。半贴壁细胞半贴壁细胞：呈现贴壁生长现象，但不牢。呈现贴壁生长现象，但不牢。悬浮细胞悬浮细胞：不需附着在固相支持物表面，不需附着在固相支持物表面，悬浮即可生长的细胞。如血细胞等。悬浮即可生长的细胞。如血细胞等。细胞生物学实验 张 伟 贴壁细胞贴壁细胞细胞生物学实验 张 伟细胞生物学实验 张 伟 悬浮型细胞。悬浮型细胞。细胞生物学实验 张

4、 伟 半贴壁细胞半贴壁细胞细胞生物学实验 张 伟 （三）细胞贴壁过程（三）细胞贴壁过程细胞生物学实验 张 伟（四）细胞传代后的四个生长阶段四）细胞传代后的四个生长阶段n潜伏期：细胞无分裂，6-24小时。n指数生长期：细胞增殖最旺盛时期，分裂相细胞的比例（分裂指数）。n停滞期：细胞数量达到饱和，细胞停止增殖，但仍有代谢活动。平台期。n衰退期：自然衰退和耗竭衰退。细胞生物学实验 张 伟培养细胞一代生长过程细胞生物学实验 张 伟（五）（五） 何时传代与如何传代？何时传代与如何传代？1. 肉眼观察培养物颜色及混浊度培养物颜色及混浊度细胞生物学实验 张 伟2. 2. 倒置显微镜观察细胞生长状态倒置显微镜

5、观察细胞生长状态细胞生物学实验 张 伟 贴壁生长细胞传代n弃掉培养液，加0.51mL的胰酶涮洗一下培养瓶，去残留的旧培养液，解除血清对胰酶的抑制作用。 n每瓶细胞加入1mL胰酶, 盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞突起收回变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶去掉。注意勿使细胞提早脱壁落入消化液中。n加入5ml的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，制成细胞悬液计数然后分装到新培养瓶中(1x105/ml ，5mL/小瓶） 。盖上瓶盖, 适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。细胞生物学实验 张 伟 细胞消化的最佳程度细胞消化的最佳程度

6、细胞生物学实验 张 伟悬浮细胞传代步骤n可将细胞培养悬液进行离心去除旧培养液上清，加入新鲜培养液，然后分装到各瓶中。细胞生物学实验 张 伟( (六六) )细胞冻存细胞冻存细胞生物学实验 张 伟 冷冻保护剂的种类及作用机制冷冻保护剂的种类及作用机制n常用渗透性冷冻保护剂主要包括常用渗透性冷冻保护剂主要包括甘油、甘油、DMSODMSO、乙、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。等。nDMSODMSO：对细胞无毒性，分子量小，溶解度好，能：对细胞无毒性，分子量小，溶解度好，能迅速透入细胞，降低冰点，提高细胞膜对水的通透迅速透入细胞，降低冰点，提高细胞膜对水的通透性，延缓冻结过程，

7、能使细胞内水分在冻结之前透性，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结之前透出细胞外，在胞外形成冰晶，提高细胞内的电解质出细胞外，在胞外形成冰晶，提高细胞内的电解质浓度，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞冻伤。浓度，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞冻伤。常用浓度为常用浓度为5%-10%5%-10%，细胞在液氮中冻存，细胞在液氮中冻存1-21-2年，存年，存活率可达活率可达80%-90%80%-90%。DMSODMSO液需预先用培养液配液需预先用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞好，避免因临时配制产热而伤害细胞 细胞生物学实验 张 伟二、实验目的 掌握无菌操作技术。 掌握传代细胞的培养的方法与步骤

8、。 掌握培养细胞的消化方法。 了解在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。细胞生物学实验 张 伟三、实验材料及设备三、实验材料及设备 1. 1. 细胞细胞 人宫颈癌人宫颈癌HeLa HeLa 细胞细胞 人胃癌人胃癌BGC-823BGC-823细胞细胞 中国仓鼠卵巢中国仓鼠卵巢CHOCHO细胞细胞2. 2. 试剂试剂 DMEMDMEM培养基、胰酶、血清、培养基、胰酶、血清、DMSODMSO、抗生素、抗生素 3. 3. 仪器仪器 超净工作台、超净工作台、COCO2 2培养箱、倒置相差显微镜培养箱、倒置相差显微镜4.4.其它用品：其它用品： 培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，培养瓶，

9、试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，7575酒精棉球，酒精灯酒精棉球，酒精灯 细胞生物学实验 张 伟四、实验步骤四、实验步骤1. .准备准备：超净工作台紫外线处理：超净工作台紫外线处理3030分钟分钟, , 用肥皂洗手用肥皂洗手, , 穿鞋套，用新洁尔灭溶液拭擦双手消毒。穿鞋套，用新洁尔灭溶液拭擦双手消毒。2. 2. 倒置显微镜下倒置显微镜下观察细胞形态观察细胞形态，确定细胞是否需要，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置将培养用液置3737C C预预热。热。3 3关闭超净台紫外灯关闭超净台紫外灯, , 打开可见光灯开关打开可见光灯开关, ,打开抽风打开

10、抽风机清洁空气，除去臭氧。用机清洁空气，除去臭氧。用75%75%酒精擦双手消毒酒精擦双手消毒 。 4.4.正确摆放超净台内的实验用品正确摆放超净台内的实验用品：酒精灯、酒精棉：酒精灯、酒精棉球、新洁尔灭纱布、试管架、滴管筒（头）、吸管球、新洁尔灭纱布、试管架、滴管筒（头）、吸管筒（头）、废液缸等。点燃酒精灯，准备好实验试筒（头）、废液缸等。点燃酒精灯，准备好实验试剂：剂：DMEMDMEM培养基（其中血清含量培养基（其中血清含量10%10%）、）、 血清、血清、胰酶等。胰酶等。细胞生物学实验 张 伟细胞生物学实验 张 伟5.点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸点燃酒精灯；取出无菌试管，巴

11、士德吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。管内。6.6.将培养液瓶（将培养液瓶（90mL) 90mL) 过酒精灯火焰后斜置于酒精灯过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。旁的架子上。7. 7. 打开血清打开血清瓶（瓶（10.5mL) 10.5mL) ，瓶口，瓶口过酒精灯火焰后斜置过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。于酒精灯旁的架子上。8. 8. 无菌吸取无菌吸取10mL10mL血清血清加入加入到到培养液（培养液（90mL)90mL)中，用中，用微量移液器加入双抗微量移液器加入双抗200200L L轻轻混匀，配置完全轻轻混匀，配

12、置完全培养基。培养基。9. 9. 在在血清中血清中（剩余（剩余0.5mL0.5mL) ) 加入加入4mL4mL完全培养基轻轻完全培养基轻轻混匀，加入混匀，加入0.5mL0.5mL DMSO DMSO（冻存保护剂），轻轻混（冻存保护剂），轻轻混匀即为冻存液匀即为冻存液 。细胞生物学实验 张 伟细胞生物学实验 张 伟10.细胞瓶口靠近火焰打开瓶盖并在酒精灯上烧口消细胞瓶口靠近火焰打开瓶盖并在酒精灯上烧口消毒，倒掉或吸出培养基（对于小口的培养瓶可采用毒，倒掉或吸出培养基（对于小口的培养瓶可采用倾倒方法倾倒方法, ,对于培养皿对于培养皿, ,必须用吸管吸出）必须用吸管吸出）11.11.加一滴管胰酶轻轻

13、漂洗一下细胞加一滴管胰酶轻轻漂洗一下细胞，弃胰酶，再，弃胰酶，再加加入一滴管或两滴管胰酶（以盖住细胞量为准入一滴管或两滴管胰酶（以盖住细胞量为准) )，转动，转动培养瓶，使其湿润整个细胞层，盖好瓶盖。培养瓶，使其湿润整个细胞层，盖好瓶盖。12.12.显微镜下观察细胞的消化状态，显微镜下观察细胞的消化状态，待细胞大部分收待细胞大部分收缩、突起、变圆，细胞边界清晰时，即可立起或翻缩、突起、变圆，细胞边界清晰时，即可立起或翻转培养瓶停止消化转培养瓶停止消化，在超净台内靠近火焰处弃胰酶，在超净台内靠近火焰处弃胰酶. .细胞生物学实验 张 伟13. 加两滴管（约加两滴管（约1.8-2mL1.8-2mL）

14、冻存液既冻存液既全面吹打细胞全面吹打细胞瓶瓶壁壁, ,吹打均匀，细胞浓度宜大，吹打均匀，细胞浓度宜大，3 310106 6个个/mL/mL左右。左右。14.14.将细胞悬液吸至冻存管中将细胞悬液吸至冻存管中，拧好盖，封好胶布，并，拧好盖，封好胶布，并标记好细胞种类，冻存时间标记好细胞种类，冻存时间，保存条件以及冻存者，保存条件以及冻存者姓名等（悬浮细胞冻存将细胞离心后再加冻存液）姓名等（悬浮细胞冻存将细胞离心后再加冻存液）15.15.在培养瓶在培养瓶( (残余少量细胞）中加入残余少量细胞）中加入5mL5mL完全培养基完全培养基及，及，盖好瓶盖（拧紧后并旋回半圈）。做好记录，倒置盖好瓶盖（拧紧后

15、并旋回半圈）。做好记录，倒置相差显微镜下观察细胞的形态，放入相差显微镜下观察细胞的形态，放入CO2CO2培养箱培培养箱培养。养。16.16.冻存管在冻存管在4 4度存放度存放30min30min，转放到，转放到2020度度 1.51.52h2h，再转到再转到7070度度4 412h12h后即可转移到后即可转移到液氮液氮内，注意做内，注意做好冻存记录好冻存记录。细胞生物学实验 张 伟把握好传代时机，80-90%汇合度阶段最好，过早细胞产量少，过晚细胞健康状态不佳消化时间要适度，过短细胞不易脱落，过长细胞可脱落流失。消化液浓度要适宜，过浓时消化作用强烈，细胞反应快，所需消化时间短，掌握不好，细胞易流失。不同细胞对消化反应