高等仪器分析-色谱联用20120911

1、色谱联用技术色谱联用技术(Hyphenated Chromotography)第一节第一节 二维色谱二维色谱TLC-TLC GC-GC HPLC-HPLC第二节第二节 色谱与色谱与MS方法联用方法联用GC-MS HPLC-MS TLC-MS为何要进行色谱联用？为何要进行色谱联用？n色谱分离色谱分离能力强能力强、检测灵敏度高、分析速度检测灵敏度高、分析速度快，快，是复杂混合物分析的首选技术，但是色是复杂混合物分析的首选技术，但是色谱的未知物定性方面往往难于给出可靠信息。谱的未知物定性方面往往难于给出可靠信息。n具有强鉴定未知物结构能力，却不具有分离具有强鉴定未知物结构能力，却不具有分离能力的方法

2、有：能力的方法有：质谱质谱(MS)、核磁共振波谱、核磁共振波谱(NMR)、红外、红外(IR)第一节第一节 二维色谱法二维色谱法n也称也称“多维多维”色谱法，已经应用得十色谱法，已经应用得十分广泛。主要指多种色谱分离技术的分广泛。主要指多种色谱分离技术的联用。联用。色谱色谱色谱联用色谱联用一、二维薄层色谱法一、二维薄层色谱法（2D TLC）n二维薄层二维薄层(2D TLC)是分离多组分复杂混是分离多组分复杂混合物的一种有效方法，基于在薄层板两个合物的一种有效方法，基于在薄层板两个垂直的方向上进行相同或不同机理的展开。垂直的方向上进行相同或不同机理的展开。 n将样品点在方形板的一角，按通常方式展将

3、样品点在方形板的一角，按通常方式展开（即第一展开方向）。开（即第一展开方向）。1.展开完毕、取出薄层板，挥去溶剂。将板展开完毕、取出薄层板，挥去溶剂。将板旋转旋转90，以与第一展开方向垂直的方，以与第一展开方向垂直的方向再次展开（即第二展开方向）。向再次展开（即第二展开方向）。如何利用二维薄层进行更有效的分离？如何利用二维薄层进行更有效的分离？n改变流动相改变流动相 第一展开方向与第二展开方向所用的第一展开方向与第二展开方向所用的流动相流动相不同，借以将单一流动相难以不同，借以将单一流动相难以分开的组分分开。分开的组分分开。如何利用二维薄层进行更有效的分离？如何利用二维薄层进行更有效的分离？n

4、改变固定相改变固定相n将固定相不同部分浸渍以不同组分，改变将固定相不同部分浸渍以不同组分，改变固定相不同部分的性质（如石蜡油）固定相不同部分的性质（如石蜡油） 。1.用一种固定相涂铺一窄带，进行一方向展用一种固定相涂铺一窄带，进行一方向展开后，再用另一种固定相涂铺板的其余部开后，再用另一种固定相涂铺板的其余部分。分。二、多维气相色谱法二、多维气相色谱法（一）常用技术（一）常用技术n手动样品馏分转移手动样品馏分转移n阀切换阀切换n无阀气控切换无阀气控切换n在线冷阱在线冷阱1.并联多柱系统并联多柱系统1、手动样品馏分转移、手动样品馏分转移n在一台色谱仪上用一根柱子将复杂样在一台色谱仪上用一根柱子将

5、复杂样品中所需分离的组分组初步分离。收品中所需分离的组分组初步分离。收集相应馏分，注入另一台色谱仪上选集相应馏分，注入另一台色谱仪上选择性不同的另一根柱子，使其得到进择性不同的另一根柱子，使其得到进一步分离。一步分离。第一根柱常用填充柱，第二根柱则第一根柱常用填充柱，第二根柱则一般用毛细管柱。一般用毛细管柱。2、阀切换、阀切换将色谱馏分从一根色谱将色谱馏分从一根色谱柱切换到另一根色谱柱，柱切换到另一根色谱柱，最简单的方式是使用最简单的方式是使用多多通阀。通阀。用于此目的的阀必须是用于此目的的阀必须是化学惰性的，无润滑油化学惰性的，无润滑油操作，在各种使用温度操作，在各种使用温度下保持密封，死体

6、积应下保持密封，死体积应尽可能小尽可能小。3、无阀气控切换、无阀气控切换n色谱仪内部可不色谱仪内部可不设可动硬件，设可动硬件，只只需调节外部气阀需调节外部气阀便可改变柱间气便可改变柱间气流方向。流方向。4、在线冷阱、在线冷阱n在线冷阱安装在两柱之间，用以收集来自第一柱在线冷阱安装在两柱之间，用以收集来自第一柱的馏分，然后送入第二柱进一步分离。的馏分，然后送入第二柱进一步分离。n最好在第一柱之后加一个检测器及辅助进样口。最好在第一柱之后加一个检测器及辅助进样口。n冷阱的冷却和加热单元均需单独设置。冷阱的冷却和加热单元均需单独设置。 从从-180升到升到300，大约，大约10微秒。微秒。n优点优点

7、：可确切知道馏分进入第二柱的时间，馏分：可确切知道馏分进入第二柱的时间，馏分在第一柱上所造成的谱带扩张影响，在进入第二在第一柱上所造成的谱带扩张影响，在进入第二柱前已完全消除。柱前已完全消除。5、并联多柱系统、并联多柱系统缺点：数据处理工作繁杂缺点：数据处理工作繁杂。三、液相和气相色谱联用三、液相和气相色谱联用n目的在于用液相色谱分离提纯复杂介质中目的在于用液相色谱分离提纯复杂介质中的的低浓度成分低浓度成分，转而用高效、高灵敏度的，转而用高效、高灵敏度的毛细管气相色谱实现分离分析的目的。毛细管气相色谱实现分离分析的目的。三、液相和气相色谱联用三、液相和气相色谱联用n难点：流动相的挥发性问题难点

8、：流动相的挥发性问题如果液相色谱流动相是挥发性溶剂时，液相色如果液相色谱流动相是挥发性溶剂时，液相色谱馏分可直接经过一保留间隙柱，引入气相色谱馏分可直接经过一保留间隙柱，引入气相色谱柱；谱柱；如果液相色谱流动相挥发性差时，要选一种挥如果液相色谱流动相挥发性差时，要选一种挥发性适当，并且足以洗脱吸附在液相色谱富集发性适当，并且足以洗脱吸附在液相色谱富集柱上的组分的溶剂，代替原来的流动相。柱上的组分的溶剂，代替原来的流动相。第二节第二节 色质联用色质联用一、气相色谱一、气相色谱/质谱联用质谱联用n质谱法：应用多种离子化技术使物质分质谱法：应用多种离子化技术使物质分子失去外层价电子形成分子离子，分子

9、子失去外层价电子形成分子离子，分子离子中的化学键又继续发生某些有规律离子中的化学键又继续发生某些有规律的断裂而形成不同质量的碎片离子，其的断裂而形成不同质量的碎片离子，其中带正电荷的离子在电场或磁场的作用中带正电荷的离子在电场或磁场的作用下，下，根据其质荷比的差异进行分离根据其质荷比的差异进行分离。n按各离子质荷比的顺序及相对强度大小按各离子质荷比的顺序及相对强度大小记录的图谱即为质谱。记录的图谱即为质谱。质谱：纯物质结构分析质谱：纯物质结构分析色谱：复杂混合物分离色谱：复杂混合物分离色谱色谱-质谱联用：共同优点质谱联用：共同优点GC-MS；LC-MS；CZE-MSm//p>

10、911314271n色谱色谱质谱联用技术，必须解决的主要质谱联用技术，必须解决的主要问题有两大方面：问题有两大方面： 是如何实现接口连接，色谱是高压或是如何实现接口连接，色谱是高压或常压下工作，质谱是高真空工作，降低常压下工作，质谱是高真空工作，降低压力使色谱柱的出口与质谱的进样系统压力使色谱柱的出口与质谱的进样系统连接，达到两部分速度的匹配；连接，达到两部分速度的匹配； 是必须除去色谱中大量的流动相分子。是必须除去色谱中大量的流动相分子。 GC-MS联用仪联用仪SampleSample 58901.0 DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETT PACKARD5972AMass

11、 Selective DetectorDCBA ABCDGas Chromatograph (GC)Mass SpectrometerSeparationIdentificationBACDADBCMS组成组成气相色谱单元气相色谱单元n柱型：样品不是十分复杂时，分离效率柱型：样品不是十分复杂时，分离效率不太重要，可采用内径不太重要，可采用内径2mm的填充柱；的填充柱；否则，选用毛细管柱。否则，选用毛细管柱。n固定液：不得有足以干扰质谱检测的严固定液：不得有足以干扰质谱检测的严重流失。有时在色谱柱出口串联一只流重流失。有时在色谱柱出口串联一只流失固定液捕集小柱。失固定液捕集小柱。气相色谱单元气相

12、色谱单元n载气：要求化学惰性，对质谱无干扰。载气：要求化学惰性，对质谱无干扰。 氮气质量大（氮气质量大（28），对低质量数质谱检测），对低质量数质谱检测有干扰，且通过分子分离器时浓缩倍数小，有干扰，且通过分子分离器时浓缩倍数小，所以一般不用所以一般不用。 氦气较昂贵，所以氦气较昂贵，所以多用氢载气多用氢载气。 为降低载气总量，常采用较低的载气流量。为降低载气总量，常采用较低的载气流量。接口技术接口技术n是气相是气相质谱联用的关键部件，起质谱联用的关键部件，起到到传输分离组分，匹配两者压力，传输分离组分，匹配两者压力，排除大量载气排除大量载气的作用。的作用。直接连接法直接连接法当使用毛细管柱时，

13、其载气流量一般为当使用毛细管柱时，其载气流量一般为2ml/min左右。左右。可用直接连接法可用直接连接法*开口分流分离器：质谱仪上直接安装固定的进口限流器，开口分流分离器：质谱仪上直接安装固定的进口限流器，同时用一个针形阀去部分色谱流出物。同时用一个针形阀去部分色谱流出物。分子分离器（浓缩型接口）分子分离器（浓缩型接口）nGC是在是在常压常压下工作，而下工作，而MS是在是在高真空高真空下工下工作，因此，必须有一个连接装置，作，因此，必须有一个连接装置，将色谱柱将色谱柱流出的载气除去，使压强降低，样品分子进流出的载气除去，使压强降低，样品分子进入离子室。入离子室。这个连接装置叫做分子分离器。这个

14、连接装置叫做分子分离器。n分子分离器包括：分子分离器包括：喷射式分子分离器、微孔喷射式分子分离器、微孔玻璃分子分离器和硅橡胶膜分子分离器。玻璃分子分离器和硅橡胶膜分子分离器。 喷射式分子分离器喷射式分子分离器（电子轰击（电子轰击MS）n在膨胀的超音速喷射气流中，不同分子量在膨胀的超音速喷射气流中，不同分子量的气体具有不同的扩散率。分子量小的载的气体具有不同的扩散率。分子量小的载气扩散快，大部分被真空泵抽走。待测样气扩散快，大部分被真空泵抽走。待测样品气分子量大，扩散慢，继续向前运动。品气分子量大，扩散慢，继续向前运动。微孔玻璃分离器微孔玻璃分离器-（化学电离（化学电离MS）n由由烧结多孔玻璃管

15、烧结多孔玻璃管构成，其微孔约构成，其微孔约1m。由。由于物质分子被真空抽走的速率与其相对分子于物质分子被真空抽走的速率与其相对分子量的平方根成反比，因此载气将先被抽走。量的平方根成反比，因此载气将先被抽走。硅橡胶膜分离器硅橡胶膜分离器n利用有机分子与载利用有机分子与载气分子通过硅橡胶气分子通过硅橡胶膜的渗透率的差异，膜的渗透率的差异，高渗透率的样品穿高渗透率的样品穿透过膜透过膜，被浓缩后，被浓缩后进入离子源。进入离子源。联机检测中对质谱仪的要求联机检测中对质谱仪的要求n质谱仪的灵敏度应与色谱系统匹配；质谱仪的灵敏度应与色谱系统匹配；n质谱仪真空系统的抽气速度能适应进入质谱仪真空系统的抽气速度能

16、适应进入质谱仪的载气流量；质谱仪的载气流量；n分辨率应满足分析要求；分辨率应满足分析要求；n扫描速度应与色谱峰流出速度相适应；扫描速度应与色谱峰流出速度相适应；n质谱系统不应有任何记忆效应。质谱系统不应有任何记忆效应。n多通道扫描（MRM）时，前一个离子通道扫描结束后，碰撞室里的离子来不及清除，影响下一个离子通道反应的定量（如果色谱分离完全则无此影响），即Cross Talk，又称记忆效应记忆效应。 四极杆质量分离器四极杆质量分离器n四极杆离子选择性高，通过率不一定高。n圆形的六极杆/八极杆优点是：混沌轨道,没有传输节点（传输节点指的是：周期性出现的离子传不过去）； n缺点是：离子容易散开，不

17、容易聚集。 n安捷伦的方形四极杆是混合了四极杆和八极杆的一个混合场，所以，综合了很多场的优点，既保持了六极杆/八极杆的优点，又实现了离子的聚中传输（Good collisional damping），即离子的聚中性更好，不散开。n抗污染设计 如AB的帘气（Crutain gas）、安捷伦的反吹气、Finnigan的美国工厂的吹扫气（Sweep gas）、Waters的Zspray 。仪仪 器器 结结 构构色谱色谱-四极杆质谱仪结构示意图四极杆质谱仪结构示意图GC-MS谱图名称谱图名称 总离子流色谱图总离子流色谱图（Total Ion current chromatogram,TIC)样品离子化

18、后形成的各种离子（包括碎片离子）样品离子化后形成的各种离子（包括碎片离子）流流强度强度随随时间时间变化的曲线。变化的曲线。横坐标：每种离子强度最大时对应的时间。横坐标：每种离子强度最大时对应的时间。纵坐标：每种离子产生信号的强度。纵坐标：每种离子产生信号的强度。 质谱图质谱图总离子流图和质谱图的关系总离子流图和质谱图的关系应用实例应用实例应用：应用：苯烷基化反应产物的检测。苯烷基化反应产物的检测。仪器：仪器：HP 6890GC-5973 MS 气质联用仪；色谱柱为气质联用仪；色谱柱为HP-5MS弹性石英毛细管柱弹性石英毛细管柱,30m250m0.25m；载气为；载气为氦气；电离方式为氦气；电离

19、方式为EI，离子源温度为，离子源温度为230，电子能量为，电子能量为70eV. 气相色谱条件：气相色谱条件：进样口温度为进样口温度为310，接口温度为，接口温度为280，进样量为，进样量为0.2l，流速为，流速为0.8mL/min，分流比为，分流比为50:1，柱温从柱温从100开始，以开始，以15/min升至升至300，保持，保持2min。C6H6 + RBr C6H5R （R=C14H29）苯烷基化产物的总离子流图苯烷基化产物的总离子流图t/min十四烷基苯的质谱图十四烷基苯的质谱图m/e二、二、LC-MS联用仪联用仪u液相色谱液相色谱质谱联用（质谱联用（LC-MSLC-MS联用）联用）对于

20、热稳定性差、不易汽化的样品，对于热稳定性差、不易汽化的样品，GSMSGSMS联用有一定的困难。因此，近年来又发展了联用有一定的困难。因此，近年来又发展了液相色谱液相色谱质谱联用技术。质谱联用技术。uLCLC分离要使用大量的液态流动相，分离要使用大量的液态流动相，如何有如何有效地除去流动相而不损失样品，效地除去流动相而不损失样品，是是LC-MSLC-MS技技术的难题之一。术的难题之一。 液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）联用技术的研究开始于20世纪70年代，与气相色谱-质谱（gas chromatograph-mass s

21、pectrometry，GC-MS）联用技术不同的是液相色谱-质谱联用技术似乎经历了一个更长的实践、研究过程，直到90年代方出现了被广泛接受的商品接口及成套仪器。nLCMS的在线使用首先要解决的问题是真空的匹配。质谱的工作真空一般要求为105Pa，要与一般在常压下工作的液质接口相匹配并维持足够的真空，其方法只能是增大真空泵的抽速，维持一个必要的动态高真空。所以现有商品仪器的LCMS设计均增加了真空泵的抽速并采用了分段、多级抽真空的方法，形成真空梯度来满足接口和质谱正常工作的要求。n 扩大LCMS应用范围以使热不稳定和强极性化合物在不加衍生化的情况下得以直接分析并将质谱分析用于生物大分子是液质接

22、口技术的发展方向。LCMS各种“软”离子化接口的开发正是迎合了这个方向。长期以来，LC与MS联用被认为是“不可能的结合” n传统的传统的HPLC系统中遇到的流量（系统中遇到的流量（0.52 mL/min的正、反相溶剂流速）和质谱仪要求的正、反相溶剂流速）和质谱仪要求的真空之间存在的难以协调性似乎太大了。的真空之间存在的难以协调性似乎太大了。 nHPLC缺乏灵敏、选择性和通用的检测器也是缺乏灵敏、选择性和通用的检测器也是HPLC和和MS联用的推动力。联用的推动力。 n液相色谱一般用来分离挥发性差，液相色谱一般用来分离挥发性差，热不稳定性样品，热不稳定性样品，接口技术接口技术不象不象气相气相/质谱

23、联用那么成熟。质谱联用那么成熟。解决方法：n扩大扩大MS真空系统的抽气容量真空系统的抽气容量n在引入真空系统之前除去溶剂在引入真空系统之前除去溶剂n牺牲灵敏度分流流出物牺牲灵敏度分流流出物n使用可在较低流量下有效工作的微型使用可在较低流量下有效工作的微型LC柱柱LC/MS的历史 1917 电喷雾(Electrospray) 被发现 (并非为了 MS) 60s-70s 大气压电离(APcI)源被发现 70s-80s 开始广泛研究 LC/MS 1979 传送带式 LC/MS 接口成为商业产品 1982 粒子束LC/MS接口出现 1984 第一台电喷雾 MS仪宣告诞生 1988 电喷雾离子源 MS

24、首次应用于蛋白质的分析离子源（ION Source）n大气压电离 (API)n 离子化过程发生在大气压下 (与在真空下的电离有本质的不同,例如,EI电子轰击离子源)n API（大气压电离）技术包括：nESI -电喷雾离子源nAPCI - 大气压化学电离源大气压电离 (API) 技术ESI 和APCI 共同点:n使用高电压元件和充气喷雾法产生气相离子n通常产生 (M+H)+ 或 (M-H)- 等准分子离子n产生极少的碎片，但可以控制产生结构碎片n非常灵敏的技术大气压电离 (API) 技术一般而言,ESI 和 APCI 不同点:(1) 生成离子方式不同 ESI - 液相离子化 APCI - 气相离

25、子化 (2)样品兼容性 ESI - 极性化合物和生物大分子 APCI - 非极性, 小分子化合物 (相对于用 ESI电离的化合物而言) 且有一定的挥发性 (3)流速兼容性 ESI - 0.001 到 1 mL/min APCI - 0.2 到 2 mL/min第二节 电喷雾电离和大气压化学电离接口与质谱联机 n一、电喷雾电离接口的结构和工作原理n 配套的电喷雾电离（ESI）接口主要由两个功能部分组成；接口本身以及由气体加热，真空度指示，附加机械泵开关组成的控制单元。较新的设计中，接口操作包含在系统的整体控制之内。ESI接口的结构如图61所示。图61 HP1100LCMSD ESI接口示意图1液

26、相人口；2雾化喷口；3毛细管；4CID区；5锥形分离器；6八极杆；7四极杆；8HED检测器n如图61所示的接口主要由大气压离子化室和离子聚焦透镜组件构成。喷口（nebulizing needle）一般由双层同心管组成，外层通入氮气作为喷雾气体，内层输送流动相及样品溶液。某些接口还增加了“套气”（sheath gas）设计，其主要作用为改善喷雾条件以提高离子化效率。例如采用六氟化硫为套气，使用水溶液做负离子测定时可以有效地减少喷口放电。n 离子化室和聚焦单元之间由一根内径为0.5mm的，带惰性金属（金或铂）包头的玻璃毛细管相通。它的主要作用为形成离子化室和聚焦单元的真空差，造成聚焦单元对离子化室

27、的负压，传输由离子化室形成的离子进入聚焦单元并隔离加在毛细管入口处的38kV的高电压。此高电压的极性可通过化学工作站方便地切换以造成不同的离子化模式，适应不同的需要。离子聚焦部分一般由两个锥形分离器（shimmer）和静电透镜（electrostatic lens）组成，并可以施加不同的调谐电压。n较新的接口设计采用六极杆或八极杆作为离子导向器（ion guide），取代或部分取代了原先的锥形分离器和静电透镜组件。六极杆或八极杆被供给5MHz的射频电压以有效地提高离子传输效率（90），灵敏度有了较大幅度的提高。nESI接口在不同的设计中一般都有两到三个不同的真空区，由附加的机械泵抽气形成。第一

28、个的真空度为200400Pa（23Torr），第二个约为2040Pa（0.10.2Torr），这两个区域与喷雾室的常压及质谱离子源的真空（前级104Pa；后级106Pa）形成真空梯度并保证稳定的离子传输。接口中设有两路氮气，一路为不加热的喷雾气，另一路为加热的干燥气，有时也因不同的输气方式被称为气帘（curtain gas）或浴气 （bath gas）。其作用是使液滴进一步分散以加速溶剂的蒸发；形成气帘阻挡中性分子进入玻璃毛细管，有利于被分析物离子与溶剂的分离；减少由于溶剂快速蒸发和气溶胶快速扩散所促进的分子一离子聚合作用。n以一定流速进入喷口的样品溶液及液相色谱流动相，经喷雾作用被分散成直径

29、约为13m的细小液滴。在喷口和毛细管入口之间设置的几千伏特的高电压的作用下，这些液滴由于表面电荷的不均匀分布和静电引力而被破碎成为更细小的液滴。在加热的干燥氮气的作用下，液涌中的溶剂被快速蒸发，直至表面电荷增大到库仑排斥力大于表面张力而爆裂，产生带电的子液滴。子液涌中的溶剂继续蒸发引起再次爆裂。此过程循环往复直至液滴表面形成很强的电场，而将离子由液满表面排入气相中。至此，离子化过程宣告完成（有关离子化的机制在本章的稍后部分有较详细的讨论）。 n进入气相的离子在高电场和真空梯度的作用下进入玻璃毛细管，经聚焦单元聚焦，被送入质谱离子源进行质谱分析。n 在没有干燥气体设置的接口中，如上离子化过程也可

30、进行，但流量必须限制在数lmin，以保证足够的离子化效率。如接口具备干燥气体设置，则此流量可大到数百lmin乃至1000lmin以上，这样的流量可满足常规液相色谱柱良好分离的要求，实现与质谱的在残联机操作。二、接口的碰撞诱导解离（CID）功能n毛细管出口与第一级分离器之间的真空区（图3l，“CID区”）的气压取决于机械泵的抽速及由处在常压下的离子化室进入毛细管的气体流量。该区的气压为数百帕，且比较稳定，是一个理想的分子离子碰撞解离区。改变施加在毛细管出口和锥形分离器之间的电压可以方便地控制碰撞能量，从而得到不同丰度的碎片离子。CID电压通常设置为50400V之间，这样的电压设置对大多数化合物可

31、以产生丰度较高的碎片。电喷雾离子源电喷雾离子化分为三个过程:n形成带电小液滴n溶剂蒸发和小液滴碎裂n最终形成气相离子在在ESI高压电极处施以正的高电压高压电极处施以正的高电压, 小液滴从毛细管高小液滴从毛细管高速喷出而带有过量的正电荷。速喷出而带有过量的正电荷。当在当在ESI高压电极处施以负的高电压，小液滴从毛细高压电极处施以负的高电压，小液滴从毛细管高速喷出而带有过量的负电荷。管高速喷出而带有过量的负电荷。大气压化学电离源（APCI）n图62 HP1100LC-MSD APCI接口示意图n1液相入口；2雾化喷口；3APCI蒸发器；4电晕放电针；5毛细管；n6CID区；7锥形分离器；8八极杆；

32、9四极杆；10HED检测器四、APCI接口的结构及工作原理nAPCI接口的结构见图62。n APCI接口的构成与ESI接口的区别在于：n 增加了一根电晕放电针，并将其对共地点的电压设置为12002000V，其功能为发射自由电子并启动后续的离子化过程。n 对喷雾气体加热，同时也加大了干燥气体的可加热范围。由于对喷雾气体的加热以及APCI的离子化过程对流动相的组成依赖较小，故APCI操作中可采用组成较为简单的，含水较多的流动相。n关于APCI接口工作原理可做如下简述：n放电针所产生的自由电子首先轰击空气中O2、N2、H2O产生如、NO、等初级n离子（Primary ion），再由这些初级离子与样品

33、分子进行质子或电子交换而使其离子化并进入气相。n 有关APCI的离子化过程将在本章的稍后部分进行讨论。大气压化学电离大气压化学电离（atmospheric pressure chemical ionization APCI)APCI的结构与电喷雾源大致相同，不同之处在于的结构与电喷雾源大致相同，不同之处在于APCI喷喷嘴的下游放置一个针状放电电极，通过放电电极的高压放嘴的下游放置一个针状放电电极，通过放电电极的高压放电，使空气中某些中性分子电离，产生电，使空气中某些中性分子电离，产生H3O+ ,N2+, O2+ O+等离子，溶剂分子也会电离，这些等离子，溶剂分子也会电离，这些离子与分析物分子进

34、行离子与分析物分子进行离子离子-分子反应，使分析物分子离子化，这些反应过程包分子反应，使分析物分子离子化，这些反应过程包括由质子转移和电荷交换产生正离子，质子脱离和电子捕括由质子转移和电荷交换产生正离子，质子脱离和电子捕获产生负离子等。获产生负离子等。大气压化学电离源主要用来分析中等极性的化合物，有些大气压化学电离源主要用来分析中等极性的化合物，有些化合物由于结构和极性方面的原因，化合物由于结构和极性方面的原因，ESI不能产生足够强不能产生足够强的离子，可以采用的离子，可以采用APCI 方式增加离子产率。方式增加离子产率。APCI 主要主要产生的是单电荷离子，所分析的化合物分子量一般小于产生的

35、是单电荷离子，所分析的化合物分子量一般小于1000Da.质量分析器质量分析器选择一定质量的离子通过一级质谱选择一定质量的离子通过一级质谱(MS1)，使其进入碰撞室，与室，使其进入碰撞室，与室内充有的碰撞气体内充有的碰撞气体(常用气体为常用气体为He，Ar，Xe等等)进行碰撞诱导裂解进行碰撞诱导裂解(collisioninduced dissociation，CID)，发生离子一分子碰撞，发生离子一分子碰撞反应，产生子离子，再经第二级质谱反应，产生子离子，再经第二级质谱(MS2)进行分析进行分析三重四极杆相对于单击四极杆的优势就在于三套四极杆同时工作，三重四极杆相对于单击四极杆的优势就在于三套四

36、极杆同时工作，这时不但可以进行简单的定量工作，还可以对样品的结构进行定性这时不但可以进行简单的定量工作，还可以对样品的结构进行定性的分析；并且可以结合四极杆突出的定量能力，对样品进行高质量的分析；并且可以结合四极杆突出的定量能力，对样品进行高质量的定性、定量同步分析。三重四极杆中有三把四极杆，其中只有前的定性、定量同步分析。三重四极杆中有三把四极杆，其中只有前后两把是高精度的四极杆，用于后两把是高精度的四极杆，用于过滤离子过滤离子（mass filter），每一把），每一把四极杆的四根杆子价格高达四极杆的四根杆子价格高达10万万20万人民币；第二把可能是四极万人民币；第二把可能是四极杆，也可能

37、是六极杆或者八极杆，用途是杆，也可能是六极杆或者八极杆，用途是打碎离子打碎离子，稍微便宜一点。，稍微便宜一点。n扫描类型选择n全扫描(Full Scan)n子离子扫描(Daughter Scan)n母离子扫描(Parent Scan)n中性碎片丢失扫描(Constant Neutral Loss Scan)n选择离子监测(SIR)n多反应监测(MRM)n全扫描用于检测离子源产生的离子流中，各种全扫描用于检测离子源产生的离子流中，各种离子的离子的m/z和强度。从全扫描得到的信息可以和强度。从全扫描得到的信息可以知道目前样品中的组分状态。知道目前样品中的组分状态。n全扫描模式下三重四极杆只有一把四

38、极杆发挥全扫描模式下三重四极杆只有一把四极杆发挥了功能，相当于单击四极杆的能力。这种模式了功能，相当于单击四极杆的能力。这种模式仅仅是为了对样品有个初步的了解。挑选需要仅仅是为了对样品有个初步的了解。挑选需要进一步分析的离子进一步分析的离子 全扫描子离子扫描 MS1 CollisionCell MS2这时这时Q1工作在工作在SIM模式，即只允许母离子这一种模式，即只允许母离子这一种m/z的离子通过；的离子通过；Q2碰撞室工作在碰撞碎裂模式（碰撞室工作在碰撞碎裂模式（CID，Collision Induced Dissociation），气压上升、碰撞能量提高；），气压上升、碰撞能量提高；Q3在

39、做全扫描，在做全扫描，检测检测Q2产生的碎片离子的产生的碎片离子的m/z和强度。和强度。用用MS2质量分析器扫描指定母离子的子离子碎片，所质量分析器扫描指定母离子的子离子碎片，所得到的质谱图只能是由指定的母离子经碰撞产生得到的质谱图只能是由指定的母离子经碰撞产生。扫描静态子离子扫描，子离子扫描，pruduct ion scann子离子扫描可以得到母离子的碎片信息。这子离子扫描可以得到母离子的碎片信息。这些信息可以帮助操作者了解母离子的结构信些信息可以帮助操作者了解母离子的结构信息，区别几种息，区别几种m/z相同的母离子，降低假阳相同的母离子，降低假阳性率。性率。子离子扫描的作用是：子离子扫描的

40、作用是： n通过母离子碎片种类和强度的差异来区别通过母离子碎片种类和强度的差异来区别m/z相同的母离子相同的母离子 n了解母离子的结构了解母离子的结构仪器内部仪器内部Q1处于全扫描模式；处于全扫描模式；Q2碰撞室工作在碰撞碎碰撞室工作在碰撞碎裂模式；裂模式；Q3用用SIM监视感兴趣的碎片。监视感兴趣的碎片。用用MS1质量分析器扫描能丢失指定质谱碎片的母离子，质量分析器扫描能丢失指定质谱碎片的母离子，扫描静态MS1Collision CellMS2母离子扫描，母离子扫描，parent ion scan母离子扫描，母离子扫描，parent ion scan选择选择MS2中的某一子离子，中的某一子离

41、子， 在在MS1中测定所有产生其子中测定所有产生其子离子的母离子。该方式能帮助追溯碎片离子的来源，能对离子的母离子。该方式能帮助追溯碎片离子的来源，能对产生某种特征碎片离子的一类化合物进行快速筛选。产生某种特征碎片离子的一类化合物进行快速筛选。中性丢失扫描，中性丢失扫描，neutrual loss scanMS1和和MS2同时扫描，但同时扫描，但MS2与与MS1始终保持质量差始终保持质量差Am，最终的谱图将显示那些来自一级谱图中通过裂解丢失中最终的谱图将显示那些来自一级谱图中通过裂解丢失中性碎片性碎片(Am)的离子。中性丢失谱最能反映化合物的特定的离子。中性丢失谱最能反映化合物的特定官能团官能

42、团 。这里的中性基团是指如脱水反应中的水分子一样的小分这里的中性基团是指如脱水反应中的水分子一样的小分子，它们在碰撞室内以碎片的方式掉下来，但是并不带子，它们在碰撞室内以碎片的方式掉下来，但是并不带电荷。电荷。仪器内部仪器内部Q1处于全扫描模式；处于全扫描模式；Q2碰撞室工作在碰撞碎裂碰撞室工作在碰撞碎裂模式；模式；Q3也处于全扫描模式。只是也处于全扫描模式。只是Q1在每一瞬间的在每一瞬间的m/z和和Q3当时的当时的m/z值之差是一个固定值，即中性碎片的值之差是一个固定值，即中性碎片的m。MS1质量分析器是静态，并且只监测指定的离子。质量分析器是静态，并且只监测指定的离子。静态 MS1 Col

43、lisionCell MS2选择离子记录选择离子记录(SIR，selected reaction monitoring）多反应监测（MRM）nMRM(Multi-reactiion monitoring)是三重四极杆最强大的功能了！其他仪器的性能无法和三重四极杆MRM的选择性和高定量精度相比。这里的“反应”指的是通过Q1选择了母离子在Q2碰撞室内碎裂成碎片的过程。一种母离子变成碎片就包含了多个反应：n化学反应：A=a+b+c通过Q1选择A，Q2碎裂A变为a、b、c，Q3测量a或b或c的强度，就可以知道A=a+b+c这一化学反应的强度，间接知道反应物A的强度。据此可以对A进行定量。n由于通过Q1

44、和Q2两重选择，可以限定母离子m/z和子离子m/z两个参数；而SIM只能固定一个m/z。母离子和子离子m/z相同的情况，大多属于具有同分异构体关系的样品，出现的概率较低，所以MRM的选择性极高。相比之下，SIM受到相似m/z离子干扰的机会大得多，其定量信噪比要低得多。n MS1 CollisionCell MS2指定的母离子产生一指定的子离子，两个质量分析器都是静态的。静态静态多反应监测（MRM）扫描模式及色谱图扫描模式及色谱图l 全扫描全扫描l 选择离子监测选择离子监测l 选择反应监测选择反应监测全扫描全扫描指质量分析器在给定时间范围内对给定质荷比指质量分析器在给定时间范围内对给定质荷比范围

45、进行无间断地扫描，获得样品中每一个组范围进行无间断地扫描，获得样品中每一个组分（或在某一特定时刻）的分（或在某一特定时刻）的全部质谱全部质谱。u 色谱色谱-质谱三维谱图质谱三维谱图u 质谱图质谱图u 总离子流色谱图总离子流色谱图u 质量色谱图质量色谱图X轴为轴为m/zy轴为时间或扫描次数轴为时间或扫描次数z轴为离子流强度轴为离子流强度色质三维谱图色质三维谱图质谱图质谱图总离子流色谱图总离子流色谱图总离子流强度随时间（扫描次数）变化的色谱图。总离子流强度随时间（扫描次数）变化的色谱图。质量色谱图质量色谱图在存储的总离子流色谱在存储的总离子流色谱图的数据中，按图的数据中，按质荷比质荷比调出的色谱图

46、调出的色谱图鉴别某化合物或具有某基团的一组化合物。鉴别某化合物或具有某基团的一组化合物。其他联用方式其他联用方式n GC-FTIRn LC-NMRn LC-LCn 其他其他1. 有机化合物在电子轰击离子源中有可能产生哪些类型的有机化合物在电子轰击离子源中有可能产生哪些类型的离子？从这些离子的质谱峰中可以得到一些什么信息？离子？从这些离子的质谱峰中可以得到一些什么信息？解：（解：（1）分子离子。从分子离子峰可以确定相对分子）分子离子。从分子离子峰可以确定相对分子质量。（质量。（2）同位素离子峰。当有机化合物中含有）同位素离子峰。当有机化合物中含有S,Cl,Br等元素时，在质谱图中会出现含有这些同

47、位素等元素时，在质谱图中会出现含有这些同位素的离子峰，同位素峰的强度比与同位素的丰度比相当，的离子峰，同位素峰的强度比与同位素的丰度比相当，因而可以也来判断化合物中是否含有某些元素（通常因而可以也来判断化合物中是否含有某些元素（通常采用采用M+2/M强度比）。（强度比）。（3）碎片离子峰。根据碎片离）碎片离子峰。根据碎片离子峰可以和阐明分子的结构。另外尚有重排离子峰、子峰可以和阐明分子的结构。另外尚有重排离子峰、两价离子峰、亚稳离子峰等都可以在确定化合物结构两价离子峰、亚稳离子峰等都可以在确定化合物结构时得到应用。时得到应用。 2.如何利用质谱信息来判断化合物的相对分子质量？如何利用质谱信息来

48、判断化合物的相对分子质量？判断分子式？判断分子式？解：利用分子离峰可以准确测定相对分子质量。解：利用分子离峰可以准确测定相对分子质量。高分辨质谱仪可以准确测定分子离子或碎片离子的质荷比，高分辨质谱仪可以准确测定分子离子或碎片离子的质荷比，故可利用元素的精确质量及丰度比计算元素组成。故可利用元素的精确质量及丰度比计算元素组成。3.色谱与质谱联用后有什么突出特点？色谱与质谱联用后有什么突出特点？n解：质谱法具有灵敏度高、定性能力强等特点。但进样要纯，才能发解：质谱法具有灵敏度高、定性能力强等特点。但进样要纯，才能发挥其特长。另一方面，进行定量分析又比较复杂。气相色谱法则具有挥其特长。另一方面，进行

49、定量分析又比较复杂。气相色谱法则具有分离效率高、定量分析简便的特点，但定性能力却较差。因此这两种分离效率高、定量分析简便的特点，但定性能力却较差。因此这两种方法若能联用，可以相互取长补短，其优点是：方法若能联用，可以相互取长补短，其优点是： (1)(1)气相色谱仪是气相色谱仪是质谱法的理想的质谱法的理想的“进样器进样器”，试样经色谱分离后以纯物质形式进入质，试样经色谱分离后以纯物质形式进入质谱仪，就可充分发挥质谱法的特长。谱仪，就可充分发挥质谱法的特长。 (2)(2)质谱仪是气相色谱法的理质谱仪是气相色谱法的理想的想的“检测器检测器”，色谱法所用的检测器如氢焰电离检测器、热导池检，色谱法所用的

50、检测器如氢焰电离检测器、热导池检测器、电子捕获检测器都具有局限性。而质谱仪能检出几乎全部化合测器、电子捕获检测器都具有局限性。而质谱仪能检出几乎全部化合物，灵敏度又很高。物，灵敏度又很高。 所以，色谱所以，色谱质谱联用技术既发挥了色谱法质谱联用技术既发挥了色谱法的高分离能力，又发挥了质谱法的高鉴别能力。这种技术适用于作多的高分离能力，又发挥了质谱法的高鉴别能力。这种技术适用于作多组分混合物中未知组分的定性鉴定；可以判断化合物的分子结构；可组分混合物中未知组分的定性鉴定；可以判断化合物的分子结构；可以准确地测定未知组分的分子量；可以修正色谱分析的错误判断；可以准确地测定未知组分的分子量；可以修正

51、色谱分析的错误判断；可以鉴定出部分分离甚至末分离开的色谱峰等。因此日益受到重视，现以鉴定出部分分离甚至末分离开的色谱峰等。因此日益受到重视，现在几乎全部先进的质谱仪器都具有进行联用的气相色谱仪，并配有计在几乎全部先进的质谱仪器都具有进行联用的气相色谱仪，并配有计算机，使得计算、联机检索等变得快捷而准确。算机，使得计算、联机检索等变得快捷而准确。 4. 如何实现气相色谱质谱联用？如何实现气相色谱质谱联用？解解:实现实现GC-MS联用的关键是接口装置，起联用的关键是接口装置，起到传输试样，匹配两者工作气体的作用。到传输试样，匹配两者工作气体的作用。 5.试述液相色谱质谱联用的迫切性试述液相色谱质谱

52、联用的迫切性解：生命过程中的化学是当前化学学科发展的前解：生命过程中的化学是当前化学学科发展的前沿领域之一。高极性、热不稳定、难挥发的大沿领域之一。高极性、热不稳定、难挥发的大分子有机化合物和生物样品难以采用分子有机化合物和生物样品难以采用GC-MSGC-MS进进行分析。液相色谱虽然不受化合物沸点的限制，行分析。液相色谱虽然不受化合物沸点的限制，并能对热稳定性差的试样进行分离、分析，但并能对热稳定性差的试样进行分离、分析，但由于其定性能力差，所以应用得到来极大的限由于其定性能力差，所以应用得到来极大的限制。这类化合物的分离分析成为分析化学家面制。这类化合物的分离分析成为分析化学家面临的重大挑战

53、。开发液相色谱与有机质谱的联临的重大挑战。开发液相色谱与有机质谱的联用技术是迫切需要解决的课题。用技术是迫切需要解决的课题。单重四级杆质谱：选择离子监测，含量测定单重四级杆质谱：选择离子监测，含量测定三重四极杆：选择离子监测，二级碎片裂解，三重四极杆：选择离子监测，二级碎片裂解，结构分析及含量测定结构分析及含量测定离子阱质谱：多级碎片裂解，结构分析离子阱质谱：多级碎片裂解，结构分析高分辨飞行时间质谱：精确质量测定和可能高分辨飞行时间质谱：精确质量测定和可能的分子式匹配的分子式匹配 Waters Q-Tof micro 系统介绍n世界上第一台台式高分辨串联质谱Q-Tof micro 高灵敏度高分

54、辨准确质量测定e-MS Q-Tof microTM 新一代的新一代的 Q-Tof 技术技术 更小巧、更智能更小巧、更智能CO=27.9949Q-TOF仪器特点n紧凑型台式高分辨串联质谱仪（LC- MSMS)n高灵敏度 ( 100 x )n高分辨 5,000 (FWHM)nMS-MS/MS 数据直接分析 (DDA) n提高外部质量测定精度使用动态外部校正 (DXC)超过19 小时，10ppm RMSn新式母离子检测特点n准确质量母离子扫描 (EPID)n准确质量的中性丢失扫描 (ENL)n数字死时间校正 DDTC，动态范围104 ne-MSWhy Q-Tof (MS-MS)? Q-Tof mic

55、roTM 准确质量的 MS/MSn精确质量的子离子扫描 (EPIDTM)广泛用于确定修饰后的氨基酸残基确定, (例如:- 糖基化, 硝基化)小分子化合物的结构定性n精确质量的中性丢失扫描 (ENLTM) 化合物结构定性生物大分子的检测和排序(例如:-磷酸化多肽)分辨率 : Quadrupole vs ToF1000 FWHM5000 FWHMQTof Micro Better quality of data without sacrificing sensitivityQuadrupole为何要高分辨率为何要高分辨率?分辨率分辨率, 质谱上是指分开两种相邻离子的能力质谱上是指分开两种相邻离子的

56、能力分辨率越高，越能区分小的质量差分辨率越高，越能区分小的质量差249249.0070249.0580249.1479低分辨条件下的3种分子，它们的整质量数一样C20H9+C19H7N+ C13H19N3O2+C20H9+C19H7N+C13H19N3O2+高分辨条件下的3种分子，它们的精确质量数不一样Q-TOF仪器特点n紧凑型台式高分辨串联质谱仪（LC- MSMS)n高灵敏度 ( 100 x )n高分辨 5,000 (FWHM)nMS-MS/MS 数据直接分析 (DDA) n提高外部质量测定精度使用动态外部校正 (DXC)超过19 小时，10ppm RMSn新式母离子检测特点n准确质量母离子

57、扫描 (EPID)n准确质量的中性丢失扫描 (ENL)n数字死时间校正 DDTC，动态范围104 ne-MS2.3.2 黄杨宁生物碱黄杨宁生物碱HPLC-MS联用鉴定联用鉴定黄杨科植物小叶黄杨Buxus microphlla Sieb. et. Zucc. var. sinica Rehd.et Wils中含有具有较强心血管疾病治疗活性的孕甾烷生物碱，主要含环维黄杨星D、环黄杨碱D和环常绿黄杨碱C等生物碱成分。环维黄杨星D和有关生物碱含量测定结果次数环维黄杨星D含量% 峰1生物碱含量%峰2生物碱含量%峰4生物碱含量%峰5生物碱含量%有关生物碱总含量% 186.853.578.090.790.9213.37287.083.848.540.800.9814.15385.833.468.820.810.9514.03485.703.548.760.870.9314.10585.053.528.640.740.8513.75684.843.749.030.790.9714.53Mean85.893.618.650.800.9313.99RSD%1.073.653.384.624.632.8环维黄杨星环维黄杨星D及其有关生物碱的鉴别及其有关生物碱的鉴别n 质谱条件 电喷雾离子化正离子检测 喷口电压