微生物限度检查法

1、检查设施及环境l单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。 l沉降菌检查环境要求环境要求l操作环境：洁净度10000级的局部洁净度100级的单向流空气区域或隔离系统，符合医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法，隔离系统按相关要求验证，内部环境符合无菌检查要求。l操作过程遵守无菌操作，防止微生物污染检验量l一次试验所用的供试品量（g、ml或cm2）-制备供试液的量。l除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；中药膜剂为50cm2；化学膜剂为100cm2。l贵重、微量样品的检验量可以酌减。 l要

2、求检查沙门菌的供试品其检验量应增加10g或10ml。l检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，大蜜丸还不得少于4丸，膜剂还不得少于4片。培养条件培养条件除另有规定外， 细菌培养温度为3035 霉菌、酵母菌培养温度为2328 控制菌培养温度为3537稀释液与缓冲液稀释液与缓冲液lpH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液l pH6.8无菌磷酸盐缓冲液l pH7.6无菌磷酸盐缓冲液l.无菌氯化钠溶液如需要，可在上述稀释剂灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。培养基培养基l微生物限度检查是建立在样品污染的微生物能在规定的培养基生长的基础上。因此，检查用的培养基质量是试验成功与否的关键因素。适宜的培养基

3、制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保证。l培养基可按处方制备，亦可使用按处方生产的符合要求的脱水培养基。质量问题。 培养基培养基胆盐乳糖发酵培养基胆盐乳糖发酵培养基l取未灭菌的胆盐乳糖培养基1000ml ，加入0.04%溴甲酚紫指示液25ml。根据要求的用量分装于含倒管的试管中。灭菌。所用倒管的规格应保证产气结果的观察。l中试管，每管一般装10ml。双料乳糖胆盐发酵培养基除蒸馏水外，其它成分加倍。培养基培养基庖肉培养基庖肉培养基l牛肉碎块的制备牛肉碎块的制备 新鲜牛肉，除去脂肪和筋腱，加水煮沸约10分钟，切成约5mm3的小块，称重，按1 3（肉 水）加蒸馏水，置410浸1820

4、小时后，煮沸1小时，用白布过滤（滤液即为1 3牛肉浸液），肉渣用自来水漂洗2次，然后加入适量氢氧化钠液，搅拌，使pH在 8.4左右，浸泡过夜，次日倾去上层水，用蒸馏水冲洗23次，放在纱布上，自动沥干（不要挤压）。将肉渣铺在搪瓷盘上，灭菌，于80100烘干，筛去碎屑，装瓶，保持干燥，备用。l 庖肉培养基的制备庖肉培养基的制备 将上述碎肉块装入合适的容器中，再加入营养肉汤培养基，碎肉的量约为1.5%，调节pH使灭菌后为应为7.30.1。灭菌。培养基哥伦比亚琼脂培养基哥伦比亚琼脂培养基 除琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.30.2，加入琼脂，加热溶化，滤过，分装，灭菌，冷至

5、4550，加入相当于20mg庆大霉素的无菌硫酸庆大霉素，混匀，倾注平皿。及稀释剂l培养基及稀释剂配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。l培养基稀释剂配制后应尽快灭菌，避免微生物的繁殖。l一般采用湿热灭菌法，灭菌程序均应验证后方可采用。以防止采用不适当的加热和灭菌条件导致灭菌不彻底或培养基颜色及PH的变化、透明度及琼脂凝固力的降低等变化，导致培养基及稀释剂不符合质量要求。 培养基的贮藏培养基的贮藏l制备好的培养基应在2-25保存。l培养基的外部应进行适当的包裹，培养基容器的塞子和保藏的条件应使配制好的培养基最低限度的失去水分，并防止微生物的污染。 供试液供试液l供试液从制备至加入检验用培养基，不得

6、超过1小时。l供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45。 l供试液的体积：100ml。供试品分类供试品分类供试品分类l液体供试品 l固体、半固体或黏稠液性供试品l需用特殊供试液制备方法的供试品 供试液制备液体供试品液体供试品l取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1 10的供试液。l 油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。l 水溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。供试液制备固体、半固体或黏稠液性供试品固体、半固体或黏稠液性供试品取供试品10g,，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其它适宜的方法，混匀，作为

7、1 10的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。 供试液制备非水溶性供试品非水溶性供试品 取供试品5g(或5ml),加至含溶化的（温度不超过45）司盘80 5g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1 20的供试液。供试液制备非水溶性供试品非水溶性供试品 取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45的pH7.0无菌氯化

8、钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇510分钟，萃取，待油水明显分层，取其水层作为1 10的供试液。 取供试品10g，加至含适量的无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的适宜容器中，剧烈振摇，使供试品充分溶解，如果需要可适当加热，但温度不得超过44，取一定量供试液趁热迅速过滤。供试液制备膜剂供试品膜剂供试品 取供试品，剪碎，加适量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（通常1 cm2加1 ml或2 ml），加100 ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，浸泡，振摇，以供试品浸液作为1 10或1 20的供试液。 供试液制备肠溶及结肠溶制剂供试品肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品10g,加pH6.8无菌磷酸盐

9、缓冲液（用于肠溶制剂）或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml，置45水浴中，振摇，使溶解，作为1 10的供试液。供试液制备气雾剂、喷雾剂供试品气雾剂、喷雾剂供试品l无菌气雾剂及含供试品抛射剂的喷雾剂由于容器内的压力大，出于对试验的准确性和操作安全考虑，应将试验容器置低温一定时间后，再无菌开启容器进行检查。l取规定量供试品，置冰冻室冷冻约1小时。取出，迅速消毒供试品开启部位周围，用无菌钢锥在容器上该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释剂（若含非水溶性成份，加适量的无菌聚山梨酯8

10、0）中，混匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1 10的供试液。供试液制备具抑菌活性的供试品具抑菌活性的供试品增加方法的可操作性l培养基稀释法 l离心沉淀集菌法 l薄膜过滤法 l中和法 培养基稀释法 取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级供试液2ml ，每1ml供试液可等量分注多个平皿，倾注培养基、混匀、凝固、培养、计数。每1ml供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为1ml的菌落数。照平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。 用途：离心沉淀集菌法 取一定量的供试液，3000转/

11、分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/分离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释剂至原规定量。 离心量、控制转速和时间 用途中和法 凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释剂或培养基中。 适用性（浓度）和无毒性确认。 用途：表4 常用的中和剂抑菌剂中和剂戊二醛硫酸氢盐酚类、乙醇、山梨酸酯稀释剂醛类稀释剂、甘氨酸、硫代硫酸盐季铵类化合物（QACs）、对羟基苯甲酸酯、卵磷脂、吐温汞类制剂硫酸氢盐、硫乙醇酸盐、硫代硫酸盐二重双胍卵磷脂碘酒、洗必泰类吐温卤化物硫代硫酸盐乙二胺四乙酸（EDT

12、A）Mg+2或Ca+2磺胺类对氨基苯甲酸薄膜过滤法 任何可过滤的样品，样品过滤的体积确定应适宜（10ml、1ml等）。细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证l确认供试品在检验条件下的抑菌性。l选择适宜的消除抑菌作用的方法及检验条件。l确定适合于该供试品的计数方法。细菌、霉菌及酵母菌计数方法平皿法薄膜过滤法细菌、霉菌及酵母菌计数l按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。l取经验证的方法制备的均匀供试液，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成1 10、 1 102、1 103等稀释级。平皿法平皿法-1l取适宜的连续23个稀释级的供试液。每稀释级每种培养基至少制备2个平皿。l培养基

13、用量：1520ml，与验证试验一致。l培养基溶化：水浴、微波炉。l倒置培养：水分、污染。平皿法平皿法-2l除另有规定外，细菌培养48小时，逐日点计菌落数，一般以48小时的菌落数报告。l霉菌、酵母菌的培养72小时，逐日点计菌落数，一般以72小时的菌落数报告。l必要时，可适当延长培养时间至57天时间。平皿法平皿法-3l菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。l若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15时，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。l TTC：0.00070.001%（显红色，抑制菌落大小）。l 乳白色软膏剂：TTC（培养基层下的菌落不易观察），涂抹法。平皿法平皿法-4l一般营养琼脂培养基用于细菌

14、计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。l含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。l特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将两种培养基上菌落数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。平皿法菌数报告规则-1l宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在30300之间、霉菌平均菌落数在30100之间的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。l当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘

15、以稀释倍数的值报告菌数。平皿法菌数报告规则-2l当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值而定。l若比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数。l若比值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。l若出现比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。平皿法菌数报告规则-3l当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。l如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以 “1乘以最低稀释倍数” 的值个报

16、告菌数。薄膜过滤法-1l可使用一般薄膜过滤器。 l检查用薄膜过滤器的滤膜孔径应不大于0.45m，直径一般为50mm。（若需要采用其他直径的滤膜，其稀释掖和冲洗液的体积应做相应的调整）l根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质，如硝酸纤维素膜可用于水溶性的、油类及低浓度乙醇样品；醋酸纤维素膜可用于高浓度乙醇样品；特殊的样品需用特殊的滤膜，如抑菌性供试品采用具有疏水性边缘及低吸附性的滤膜。薄膜过滤法薄膜过滤法-2l滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法进行灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。l水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的

17、最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。l供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml，冲洗液、冲洗量及冲洗方法同方法验证试验。每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。薄膜过滤法薄膜过滤法-3l取相当于每张滤膜含1g或1ml的供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。l若供试品每1g或1ml所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液1ml，过滤。l用无菌pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其它适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证”。l冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出

18、粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。l每种培养基至少制备一张滤膜。薄膜过滤法薄膜过滤法-4l阴性对照试验：阴性对照试验： 取试验用的稀释剂1ml按上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。l培养和计数：培养和计数： 培养条件和计数方法同平皿法。l菌数报告规则：菌数报告规则：每片滤膜上生长的菌落数应不超过100个。l以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告之；若滤膜上无菌落生长，以 1报告菌数（过滤1g或1ml的供试品）或1乘以稀释倍数的值报告“1最低稀释倍数” 菌数。控制菌检查法l供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培养基的实际用量同控制菌检查方法的验证。l阳性对照试验阳性对照试验 供试品进行控制菌

19、检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10100cfu，l阴性对照试验阴性对照试验 取稀释剂10 ml加入100 ml（或200 ml）相应控制菌检查用的增菌培养基中，培养。 大肠埃希菌检查 供试品 供试液 不少于100ml的 胆盐乳糖增菌液 35371824h 取 0.2ml 5mlMUG培养基中 35375、24h366nm紫外光下观察 加靛基质试剂 MUG阳性，靛基质 阳性 MUG阴性，靛基质 阳性MUG阴性，靛基质 阴性 MUG阳性，靛基质 阴性 取胆盐乳糖培养液划线 报告 曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板 3611824h 阳性 阴性 镜检、适宜的生化试验适宜的生化试验

20、报告 报告 铜绿假单胞菌检验 供试品 供试液 不少于100ml的 BL增菌液 35371824h 溴代十六烷三甲胺平板 35371824h 营养琼脂斜面 35371824h氧化酶、 革兰染色镜检 氧化酶阴性 氧化酶阳性 非革兰阴性无芽孢杆菌 革兰阴性无芽孢杆菌 报告 绿脓菌素 绿脓菌素阳性 绿脓菌素阴性 报告 适宜的生化试验 报告沙门菌检验 供试品10g/ml 不少于200ml的营养肉汤 35371824h 四硫磺酸盐增菌液10ml 3537 1824hDHL, EMB,MacC 3537 1824h 无典型菌落 三糖铁琼脂（TSI) 3537 1824h 报告 斜面未见红色（黄色） 其他 底

21、层未见黄色（黑色） 报告 血清凝集、适宜的生化试验大肠菌群检查程序 供试液 10ml胆盐乳糖发酵管 35371824h 不产酸、不产气 产酸、产气 大肠菌群阴性 曙红亚甲蓝琼脂平板 或麦康凯琼脂平板 报告 35371824h 无典型菌落 革兰阴性无芽孢杆菌 报告 乳糖发酵管 35371824h 产气 不产气 大肠菌群阳性 大肠菌群阴性 报告 报告 可能的大肠菌群数表各供试品量的检出结果最可能的大肠菌群数N（个/g或ml）0.1g或0.1ml0.01g或0.01ml0.001g或0.001ml+103+-102 N103+-10N102-10 金黄色葡萄球菌检验程序 供试品 供试液 不少于100

22、ml的亚碲酸钠肉汤 (营养肉汤） 35371824h 卵黄氯化钠平板或甘露醇氯化钠平板 35372472h 无菌落 营养琼脂斜面 3537 1824h 报告 血浆凝固酶试验，革兰染色镜检 梭菌的检验程序梭菌的检验程序 供试品 供试液10ml(相当于供试品1g、1ml) 80 10min 迅速冷却 | 100ml 0.1%疱肉培养基 3537 厌氧7296h 产气、碎肉消化恶臭 不产气、无消化碎肉，无恶臭 0.2ml 涂抹 含庆大霉素的哥伦比亚琼脂平板 3537 厌氧4872h 报告 有菌落生长 无菌落生长 过氧化氢酶试验，镜检 报告 过氧化氢酶阴性，革兰阳性梭菌 非左述反应 报告检出 报告未检

23、出梭菌检查法l庖肉培养基：营养成分、PH、去氧。l增菌容器l厌氧条件l哥伦比亚琼脂培养基 ：营养成分、庆大霉素量。梭菌检查法-1 取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml）2份，其中1份置80保温10分钟后迅速冷却。上述2份供试液直接或处理后分别接至100ml的新鲜庖肉培养基中。另1管加入稀释液1ml，为阴性对照组。各管在厌氧条件下培养72-96小时。如试验管不出现混浊、产气、消化碎肉、臭气等现象，判供试品未检出梭菌；否则，应取上述培养物0.2 ml，涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上，在厌氧条件下培养48-72小时。若平板上无菌落生长，判供试品未检出梭菌；若平板上有菌落生长，应

24、挑选23个菌落分别进行革兰染色和过氧化氢酶试验。梭菌检查法-2l过氧化氢酶试验过氧化氢酶试验 取上述平板上的菌落，置洁净玻片上，滴加3%过氧化氢试液，若菌落表面有气泡产生，为过氧化氢酶试验阳性，否则为阴性。l若上述可疑菌落为革兰阳性梭菌，有或无卵圆形或球形的芽孢，过氧化氢酶阴性，判供试品检出梭菌，否则判供试品未检出梭菌。药品微生物限度检查结果判断l若供试品检出控制菌或其它致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。l若细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种的规定，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以3次结果的平均值报告菌数。l 眼用制剂检出霉菌和酵母菌时，须以两次复试结果均不得长菌，

25、方可判供试品的霉菌和酵母菌数符合该品种的项下规定。l若供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数、控制菌三项检验结果均符合该品种的规定，判供试品符合规定。若其中任何一项不符合该品种的规定，判供试品不符合规定。药包材标准药包材标准l低密度聚乙烯药用滴眼剂瓶低密度聚乙烯药用滴眼剂瓶YBB00062002(第一辑第一辑)l聚丙烯药用滴眼剂瓶聚丙烯药用滴眼剂瓶YBB00072002(第一辑第一辑)l口服液体药用聚丙烯瓶口服液体药用聚丙烯瓶YBB00082002(第一辑第一辑)l口服液体药用高密度聚乙烯瓶口服液体药用高密度聚乙烯瓶 YBB00092002(第一辑第一辑)l口服液体药用聚酯瓶口服液体药用聚酯瓶YBB00102002(第一辑第一辑)l口服固体药用聚丙烯瓶口服固体药用聚丙烯瓶YBB00112002(第一辑第一辑)l口服固体药用高密度聚乙烯瓶口服固体药用高密度聚乙烯瓶 YBB00122002(第一辑第一辑)l药品包装用复合膜、袋药品包装用复合膜、袋YBB00132002(第一辑第一辑)l聚酯、铝、聚乙烯药品包装用复合膜、袋聚酯、铝、聚乙烯药品包装用复合膜、袋 YBB00172002(第二辑第二辑)l聚酯、低密度聚乙烯药品包装用复合膜、袋聚酯、低密