特异性抗原刺激胞内细胞因子检测

1、特异性抗原刺激胞内细胞因子检测特异性抗原刺激胞内细胞因子检测 BD FACS应用苏州跃亚生物技术有限公司苏州跃亚生物技术有限公司Tel址：网址：检测方法检测方法流式细胞术(Flow Cytometry)酶联斑点法（ELISPOT）原位杂交免疫组化单细胞PCR流式检测胞内细胞因子原理流式检测胞内细胞因子原理 细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。细胞因子可以调节细胞生长、分化以及一系列功能，并且介导正常与病理性免疫应答。 检测单个细胞的多个参数，包括大小、颗粒度、荧光标记抗体检测细胞表面抗原、胞内抗原。 抗细胞因子抗体与细胞表面特定亚群标志组合

2、，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌。 细胞因子检测的主要临床应用细胞因子检测的主要临床应用机体免疫状态的评估疾病预后及治疗监测指标病理变化和损伤机理研究药物/疫苗效果的评估人人Th1/Th2和和Tc1/Tc2的检测的检测Th1 和Th2 细胞均分泌多种细胞因子:Th1 细胞主要分泌IL-2、IL-12、IFN-和TNF-/a等;Th2 细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6 和IL-10 Th1：CD4+IFN-+， Th2：CD4+IL-4+ Tc1：CD8+IFN-+, Tc2：CD8+IL-4+常用细胞因子检测常用细胞因子检测 除IFN-和IL-4 外，IL-1a、IL-1b、IL-

3、2、IL-6、IL-10、IL-12 TNF-a 等也是Th1/Th2 或Tc1/Tc2 所分泌的细胞因子，虽然不是非常特异，但在某些疾病中同样发挥着重要的作用，因此也有检测的必要。 分离制备细胞 活化细胞 封闭细胞表面Fc受体 细胞表面抗原染色 固定和通透 细胞内细胞因子染色 流式细胞仪测定和结果分析技术流程技术流程仪器设备仪器设备1275mm有盖的Falcon管 （BD Catalog No.2058）37孵箱7CO2混匀振荡器离心机加样器、TipsFACS流式细胞仪1 1 单细胞悬液的制备单细胞悬液的制备1.1 全血 使用肝素钠抗凝的VACUTAINER真空采血管（BD VACUTAIN

4、ER Catalog No.367673）, FastIMMUNE 不易采用肝素锂，EDTA和ACD抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。1.2 1.2 自身血浆中外周血单个核细胞自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs)(PBMCs) 使用肝素钠抗凝的BD VACUTAINER 细胞制备管（CPTs）（BD VACUTAINER Catalog No.362753）24小时内分析。1.3 1.3 组织培养基中的外周血单个核细胞组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs)(PBMCs) 用Fico

5、ll分离PBMCs，调节细胞浓度2106细胞/mL于含10热灭活胎牛血清（FBS）的RPMI1640。1.4 1.4 细胞系与细胞系与T T细胞克隆细胞克隆 调节细胞浓度2106细胞/mL于新鲜培养基中。1.5 冰冻全血与PBMCs 应用1FACS溶血素，溶血固定激活全血或PBMCs用PBS漂洗，并用含1的BSA及10的DMSO的PBS，冻存70。溶化后细胞置于染色管中，加上23mL的洗液，离心5分钟500g，然后用FACS 通透液 通透与染色。2 2 细胞的活化细胞的活化 除检测高丰度的和病理情况下表达异常亢进的细胞因子，可取样品细胞直接测定外，一般需要选用适当活化条件，先活化细胞，使之合成

6、欲检测的细胞因子。 Brefeldin(BFA) 阻断胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。 活化T细胞：植物血凝素（PHA）、巴豆酯（PMA）、离子霉素（ionomycin）、钙离子载体A23187、T细胞受体抗体、CD3抗体、抗原等。活化B细胞：脂多糖（LPS）、金黄色葡萄球菌肠内毒素A及B细胞受体抗体、抗原等。活化单核细胞： LPS等刺激素协同激活刺激素协同激活 通常选用的刺激素为PMA(佛波酯)+ Ionomycin(离子霉素)。 其中PMA为PKC(蛋白激酶C)的激活物，PKC 则可激活下游众多的蛋白激酶的磷酸化，形成级联反应，导致许多蛋白

7、的表达，进而引起T 细胞的活化。在细胞内，PKC 可被DAG(二脂酰甘油)和Ca2+的共同作用而激活，因此在Ionomycin(Ca2+的转运剂，可将细胞器内的Ca2+转运至胞浆内)的参与下，T 细胞内PKC 可被进一步激活。可见，PMA 与Ionomycin 协同活化T 细胞。 PMA+inonmycin PMA+inonmycin（PMA+IPMA+I） 全血或PBMCs用无血清的RPMI1640 1：1稀释（此稀释只适用PMA+I激活，细胞浓度2X106 / mL则无须稀释）25ng/mL PMA（25L工作液/mL全血），1g/mL inonmycin（20L工作液/mL全血），10g

8、/mLBFA（20L工作液/mL全血）共刺激37 ，7%CO2 ，4小时孵育（最好用培养箱，松盖，可控制PH值；若用水浴需旋紧盖子。）其它刺激剂其它刺激剂SEBSEB 未稀释血用10g/mLSEB与10g/mL BFA刺激37 ，7%CO2 ，4 6小时孵育CD2/CD2RCD2/CD2R 未稀释血用20g/mL CD2/CD2R与10g/mL BFA刺激37 ，7%CO2 ，4 6小时孵育CD3CD3 稀释血用CD3与10g/mL BFA刺激37 ，7%CO2 ，4 6小时孵育。建议使用CD5PerCP或CD45PerCP作FL3标记，因为CD3抗原因与CD3交联而减弱。CD28CD28 用

9、10g/mL CD28（BDIS Cat.No.550017）可以增强CD3、CD2/CD2R、SEB等激活效应。3. 3. 对照对照未刺激对照同型对照激活对照3.1 3.1 未刺激对照未刺激对照 未刺激对照用于评价体外激活过程中生成的细胞因子水平。血样与10g/mLBFA共孵育，不加刺激剂。3.2 3.2 同型对照同型对照 同型对照用于检测细胞与抗体非特异结合所至非特异染色。所选用的抗-KLH同型对照专为胞内检测设计，省去昂贵与繁琐的重组细胞因子竞争封闭步骤。 3.3 3.3 胞内染色对照胞内染色对照 胞内染色对照通过胞内CD69染色与激活对照结果比较来评价通透与胞内染色是否正确进行。如果激

10、活对照阳性率大于90%而胞内CD69未达到相应水平则通透与胞内染色步骤出了问题，确定你是否严格按照操作步骤进行实验，重新开始实验。取部分血样加PMA+I+BFA省略表面染色，胞内染色CD69PE/CD3PerCP（BDIS Cat.No.340368）以FL3 设阈值CD3设门检测CD69，胞内CD69染色阳性率应在90%以上。4. 4. 染色染色 抗细胞因子抗体可以与细胞表面标志抗体联用以研究不同细胞亚群。通透后同时加入所有荧光标记抗体以便所有表位同时着色。 表面染色试剂做胞内染色时需重新调试滴度以得到最佳结果。表面标志的胞内染色需与表面染色结果比较确定是否相当。CD3，CD4，CD8抗原既

11、可在通透前表面染色也可在通透后胞内染色，但这并不适用于所有抗原，因为其表位对多聚甲醛敏感性不同。4.1 表面染色表面染色加BDIS表面染色试剂20L于Falcon管中加100L 稀释的PMA+I激活的全血或50L未稀释全血（其他方式激活）于表面染色试剂中（用无血清的RPMI1640 1：1稀释的全血或PBMCs只适用PMA+I激活，细胞浓度2X106 / mL则无须稀释）混匀，室温暗处孵育15分钟4.2 4.2 通透与胞内染色通透与胞内染色加2mL 1XFACS 溶血素，室温暗处孵育10分钟。PBMCs或培养细胞染色时，加入FACS 溶血素可以固定表面表位，优化通透过程。离心500g 5分钟，

12、弃上清，加500L 1XFACS通透剂室温暗处孵育10分钟。加23mL洗液，离心500g 5分钟，弃上清。加入荧光标记的细胞因子抗体，混匀，室温暗处孵育30分钟。加23mL洗液，离心500g 5分钟，弃上清，加入500L 1% PFA。5. 5. 分析分析应用BD FACS流式细胞仪分析。使用CaliBRITE标准微球，FACSComp（1.1版本以上）软件调节流式细胞仪PMT电压，荧光补偿，灵敏度。用CellQuest获取，用荧光或FSC设阈值，一般门内收集10，000细胞。抗体配色抗体配色MarkerMarkerDyeDyePurposePurposeViolet viability dy

13、eViolet viability dye PacBlu channel 去除死细胞CD3CD3 PerCP-Cy5.5细胞表面抗体CD8CD8APC-Cy7 CD69CD69PEIFN-IFN- PE-Cy7细胞因子抗体IL-2IL-2 PETNF-TNF-FITCIL-4IL-4 APC抗体组合抗体组合 细胞表面标记抗体：CD3-PerCP-Cy5.5， CD8-APC-Cy7, CD69-PE 细胞内因子抗体：IFN-PE-Cy7, IL-4-APC，IL-2-PE, TNF-FITC 同型对照： Mouse IgG1-PE-Cy7 (对应于IFN-PE-Cy7)， Rat IgG1-A

14、PC (对应于IL-4-APC), Mouse IgG1-PE (对应于IL-2-PE，CD69-PE), Mouse IgG1-FITC (对应于TNF-FITC), 管管号号FITCPEPerCP-Cy5.5PE-Cy7APCAPC-Cy7Violet注释注释1MIgG1CD3第第2管同型对照管同型对照2CD69CD3质控刺激和破膜质控刺激和破膜效果效果3MIgG1MIgG1CD3M IgG1RIgG1CD8+第第4管同型对照管同型对照4TNF-IL-2CD3IFN-IL-4CD8+未刺激未刺激5M IgG1M IgG1CD3M IgG1RIgG1CD8+第第6管同型对照管同型对照6TNF-IL-2CD3IFN-IL-4CD8+刺激刺激抗体组合抗体组合CD4+和和CD8+细胞细胞Th 细胞的表面标志为CD3+CD4+，而当用PMA 刺激4 小时时，会发现CD4+的细胞明显减少，甚至