肝炎的分子诊断与临床应用

1、 肝炎分子诊断项目开展介绍 目目 录录1、了解肝炎分子诊断2、分子诊断在HBV中的临床应用3、分子诊断在HCV中的临床应用4、ADICON已开展的肝炎分子诊断项目 我国乙肝病毒感染率概况 2006200620102010年全国乙型病毒性肝炎防治规划年全国乙型病毒性肝炎防治规划显示，中国是乙型肝炎病毒感染和发病人数最多的国显示，中国是乙型肝炎病毒感染和发病人数最多的国家，全国有家，全国有6.96.9亿亿人曾感染过乙肝病毒，其中人曾感染过乙肝病毒，其中1.21.2亿亿人人长期携带乙肝病毒。长期携带乙肝病毒。目前全国慢性乙肝病人目前全国慢性乙肝病人20002000万万人，每年死于与乙人，每年死于与乙

2、肝相关的肝病患者达肝相关的肝病患者达2828万万例，发病率和死亡率都位居例，发病率和死亡率都位居前三位。每年造成的直接经济损失约达前三位。每年造成的直接经济损失约达36003600亿亿元人民元人民币。币。我国乙肝病毒感染率概况我国乙肝病毒感染率概况什么是分子诊断什么是分子诊断 在临床上应用核酸（在临床上应用核酸（DNA/RNA) DNA/RNA) 和分子生物学技术和分子生物学技术, , 在基因水平诊断和监控疾病情况和疗效，评估疾病的在基因水平诊断和监控疾病情况和疗效，评估疾病的检测方法。检测方法。分子技术在乙肝诊断与治疗中应用分子技术在乙肝诊断与治疗中应用HBV HBV 分子诊断的分子诊断的临

3、床应用临床应用高灵敏度高灵敏度HBV DNAHBV DNA定量定量HBV 感染监测药物疗效检测感染早期检测HBV HBV 基因分型基因分型病情预后发展检测抗病毒药物效果预测P P区耐药检测区耐药检测抗药性监测治疗药物选择C C区启动子变异区启动子变异确定病毒变异类型判断治疗效果确定治疗方案S S 区变异区变异确定隐觅性病毒变异判断疫苗效果判断肝炎预后高灵敏度乙肝DNA检测高精度病毒载量检测系统（ COBAS AmpliPrep/Cobas TaqMan ）高灵敏度乙肝DNA检测优势 定量PCR技术检测患者的血清HBVDNA含量，能更准确地反映病毒复制程度，对HBV相关疾病的诊断、治疗、判断预后

4、意义重大。 QF-PCR是国内常用的定量检测血清HBVDNA水平的方法，COBAS 系统是美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于血清HBVDNA定量检测的方法。它具有灵敏度高，线性范围广，实时监控，重复性好，可检测A、B、C、D、E、F、G、前C区变异等多基因型DNA载量优点。 由于本QF-PCR试剂盒的线性范围为1.0 x 103 copiesmL1.0 x 108 copiesmL，对于低于1.0 x 103 copiesmL标本的检测结果不能给出具体拷贝值，有存在漏检的可能。 而COBAS 系统线性范围为20-1.7108 IU/mL，因此， COBAS 系统更能准确反映血清HBV D

5、NA含量。COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0检测灵敏度20 IU/mL 线性范围20 1.7 x 108 IU/mL检测基因型A-H检测样本量650 mLSample Type血清或EDTA抗凝血浆SFDA注册证Q3CobasCobas 高灵敏度乙肝：20 IU/mL准确判断治疗起点准确判断治疗起点/ /终点终点线性范围线性范围乙肝：乙肝：20-1.720-1.710108 8 IU/mLIU/mL极佳的重复性，结果可靠极佳的重复性，结果可靠正确指导抗病毒治

6、疗正确指导抗病毒治疗每批试剂均使用每批试剂均使用WHOWHO标准品校准标准品校准保证定量结果的准确性保证定量结果的准确性和可溯源性和可溯源性每个样本使用同每个样本使用同源性内标定量源性内标定量避免结果不准确避免结果不准确采用采用AmpEraseAmpErase酶酶减少交叉污染减少交叉污染目前在目前在国内唯一国内唯一满足治疗指南和专家共识的满足治疗指南和专家共识的HBV HBV DNADNA和和 HCV RNAHCV RNA检测试剂检测试剂HBV DNA 监测的重要性监测的重要性 口服核苷（酸）类似物疗效评估口服核苷（酸）类似物疗效评估部分病毒学应答部分病毒学应答60 2,000 IU/mL加其

7、他药物治疗每3个月监测HBV DNA开始治疗开始治疗- - 基于基于 HBV DNAHBV DNA、 ALTALT水平和疾病发展阶段水平和疾病发展阶段治疗第治疗第1212周评估是否存在原发性无应答周评估是否存在原发性无应答 (较基线下降1 log)治疗第治疗第2424周评估周评估完全病毒学应答完全病毒学应答 2,000 IU/mL改用或加用更强药物每6个月监测HBV DNA*Keefe, E. Clin Gastro Hepatology. 2007; (5):890-897. 抗病毒治疗应将HBV DNA降至尽可能低的浓度，理想是低于实时定量 PCR方法（灵敏度灵敏度10-15 IU/mL1

8、0-15 IU/mL）的最低检出限1 1. EASL HBV Guidelines. J Hepatology. 2009;50:277-242CHB疾病管理疾病管理:治疗目标治疗目标HBsAgHBsAg清除及血清学转换清除及血清学转换治疗终点治疗终点ALTALT正常正常组织学改善组织学改善HBV DNAHBV DNA降低降低/ /消失消失HBeAgHBeAg血清学转换血清学转换HBeAgHBeAg消失消失cccDNA cccDNA 清除清除*Lok, A.S.F et.al. “Chronic Hepatitis B: Update 2009.” HEPATOLOGY, Vol 50, No

9、. 3, 2009, pgs 8-9 治疗终点治疗终点 20092009年年EASLEASL指南提出的治疗终点：指南提出的治疗终点： 最最理想的理想的治疗终点：持续的治疗终点：持续的HBsAg HBsAg 消失，伴或不伴抗消失，伴或不伴抗HBs HBs 抗体出现。抗体出现。 满意的满意的治疗终点：在治疗终点：在HBe Ag HBe Ag 阳性患者中，出现持续的阳性患者中，出现持续的HBeAg HBeAg 血清转换血清转换 次级的满意次级的满意治疗终点：尽可能降低病毒治疗终点：尽可能降低病毒DNADNA水平（降至实时定量水平（降至实时定量 PCRPCR检测限以下：检测限以下：10-15IU/ml

10、10-15IU/ml）HBVHBV基因分型基因分型根据根据HBVHBV全基因核苷酸序列的差异，分为不同基因型全基因核苷酸序列的差异，分为不同基因型: :A.B.C.D.E.F.G.H共8个型 不同的基因型具有不同地域分布不同的基因型具有不同地域分布 我国主要是BC型为主，偶有A型 北方C型HBVHBV基因分型检测临床意义基因分型检测临床意义特征基因型基因型B B型型C C型型感染性感染性低高HbeAgHbeAg阳性率阳性率低高HbeAgHbeAg自然清除时间自然清除时间短长HBV DNAHBV DNA载量载量低高致病性致病性轻重HCCHCC发生率发生率低（低年龄组高）高（高年龄组高）干扰素治疗

11、完全应答率干扰素治疗完全应答率高低抗病毒治疗效果抗病毒治疗效果高低肝癌手术治疗预后肝癌手术治疗预后好差癌栓栓塞治疗效果癌栓栓塞治疗效果好好差HBV变异的基础变异的基础 乙肝病毒:高变异性 1/105 24h 一万亿-十万亿拷贝*变异：一千万一亿 复制过程:DNA-RNA-DNA HBV逆转录酶:缺乏严格的校正机制 变异:自然变异,免疫压力等等原本有效的药物对发生耐药变异后的病毒束手无策变异前，药物有效抑制病毒变异后，药物对病毒束手无策乙肝病毒P区耐药P P区耐药位点检测区耐药位点检测HBVHBV病毒耐药性检测病毒耐药性检测长期使用抗病毒药物可引起HBV耐药，引起耐药的基因突变位点主要集中于P区

12、 原因：抗病毒药物作用在病毒P区药物靶点上，引起相关基因变异，使得药物与相关靶点作用下降，进而产生耐药。抗病毒治疗后抗病毒治疗后HBV从病毒变异到临床耐药从病毒变异到临床耐药原发无应答原发无应答病毒学（部分）病毒学（部分）应答应答临床耐药抗病毒治疗后抗病毒治疗后HBV从病毒变异到临床耐药从病毒变异到临床耐药病毒耐药的临床影响病毒耐药的临床影响 耐药病毒的出现使后续治疗的药物疗效降低耐药病毒的出现使后续治疗的药物疗效降低 耐药病毒的出现抵消了之前获得的临床益处耐药病毒的出现抵消了之前获得的临床益处病毒反弹病毒反弹, , 血清转氨酶升高血清转氨酶升高, HBeAg, HBeAg血清转换率降低血清转

13、换率降低肝脏病理进展肝脏病理进展肝硬化病人出现肝功能失代偿和死亡肝硬化病人出现肝功能失代偿和死亡肝移植后肝炎复发率增高肝移植后肝炎复发率增高 公共卫生危害公共卫生危害耐药病毒株的传播耐药病毒株的传播免疫逃逸免疫逃逸病毒的水平越低，耐药发生的几率越病毒的水平越低，耐药发生的几率越低低初治患者耐药发生率初治患者耐药发生率拉米夫定,阿德福韦,恩替卡韦为基因型耐药发生率,替比夫定为因耐药发生的病毒学反弹发生率P区耐药位点检测区耐药位点检测 长期使用抗病毒药物可引起HBV耐药，引起耐药的基因突变位点主要集中于P区 耐药基因分析在临床药物选择上的应用 目前最常见P区耐药位点11个（169、173、180、

14、181、184、194、202、204、233、236、250） 拉米夫定 M204I/V L180M V173L 恩曲他滨 V173L L180M M204I/V 阿德福韦 A181V N236T 恩替卡韦 T184A（G/I/S) M250V 特比夫定 M204I/V常用抗病毒药物的耐药位点常见变异的交叉耐药性敏感敏感界于中间界于中间耐药耐药抗病毒药物的选择和使用抗病毒药物的选择和使用1.一种药物产生耐药时，需要用具有不同耐药位点药物代替2.为减少耐药情况，建议从治疗开始就使用具有两种不同耐药位点药物一起治疗3.由于抗病毒药物的耐药以及治疗的长期性，在治疗过程中应该定期检查，或是在发现药物

15、治疗效果不佳时需排除产生耐 药的可能药物治疗慢性乙肝患者管理路线图药物治疗慢性乙肝患者管理路线图检测检测检测检测耐药检测项目耐药检测项目 目前检测的变异位点： P区耐药位点11个（169、173、180、181、184、194、202、204、 233、236、250） 专门检测LAM变异位点：180，181，204，173 专门检测ADV变异位点：181，233，236艾迪康医学检验中心艾迪康医学检验中心P P区基因变异检验报告单区基因变异检验报告单样张样张 丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒l传播途径:主要血液/体液传播(似HBV)l是引起输血后慢性肝炎和肝硬化主要原因l无症状HCV携带者和慢性丙肝

16、者多见l感染HCV后，慢性化的比例高达50%以上l免疫力不牢固黄病毒科 丙型肝炎病毒属球形有包膜的RNA病毒，直径50nm病毒基因为单股正链RNA，链全 长约10Kb HCV RNA 检测 确定引起病毒性肝炎的直接原因 通过病毒数量变化来监测治疗效果实时荧光PCR法：检测三个基因型（1型、2型、3型）PCR产物直接测序法：1-6型及亚型1a,1b,1c,2a,2b,2c,2i,2k,3a,3b,4a,5a,6a,6b,6kHCV基因分型专用申请单专用申请单病程，病史病程，病史目前用药情况，服目前用药情况，服药时间药时间 肝 炎肝 炎 分 子 诊 断 综 合 检 查 申 请 单分 子 诊 断 综

17、 合 检 查 申 请 单 姓名 必填 性别（必填） 男 / 女 年龄 必填 门诊号 科别 住院号 病房 床号 送检医院 送检医生 必填 医生联系电话 必填 采集时间（必填） 年 月 日 时 送检时间（必填） 年 月 日 时 临床印象：临床印象： 乙肝 丙肝 混合性肝炎 肝硬化 肝癌 肝纤维化 现病史现病史（临床表现以及病程） 抗病毒药物使用情况： 拉米夫定(贺普丁)_ 年 月至_ 年 月 阿德福韦(贺维力)_ 年 月至_ 年 月 恩替卡韦_ 年 月至_ 年 月 替比夫定_ 年 月至_ 年 月 替诺福韦_年 月至_ 年 月 干扰素_ 年 月至_ 年 月 恩曲他滨_年 月至_ 年 月 检测项目（注

18、意：请在要检测的项目前打“检测项目（注意：请在要检测的项目前打“”确认”确认 ） 核苷类似药药物敏感性核苷类似药药物敏感性 HBV P 区耐药检测 拉米夫定耐药检测 阿德福韦酯耐药检测 e e 抗原阴性抗原阴性 HBV 前 C 区和 C 区变异检测 HBV 前 C 区 1896 位点检测(荧光定量 PCR 法) HBVC 区 1762/1764 位点检测(荧光定量 PCR 法) 预后及动态监测预后及动态监测 高灵敏度 HBV-DNA（罗氏罗氏 COBASCOBAS：最低检测下限最低检测下限 12 12 IUIU，EDTAEDTA 抗凝血浆抗凝血浆 2ml2ml，适用于常规乙肝定量阴性的患者）

19、HBV 基因分型(测序法：8 个基因型) HBV 基因分型(荧光 PCR 法：2 个基因型) HBV 前 S 区和 S 区变异检测 HCV 基因分型(测序法：6 个基因型及其亚型) HCV 基因分型(荧光 PCR 法：1a、1b、2a、2b、2c、3a) 其他肝炎病毒核酸检测(荧光定量 PCR 法) 标本类型标本类型（必填）（必填） 血清 EDTA 抗凝血浆（紫头管） 粪便（HAV、HEV 核酸检测） 备注备注 1、采集血清(浆)量 2ml，抗凝血标本请将血浆分离后送检，粪便请使用专用粪便采集器送检具体详见传染病项目传染病项目标本取材及物流注意事项标本取材及物流注意事项； 2、对于收集后当天进

20、行检测的血清（浆）样本，可在 4oC 条件下保存运送，如需长期保存请保持-30oC 以下条件冰冻保存；粪便样本请在 4oC 条件下 48 小时内送达实验室。 3、为了能为了能及时及时并准确并准确检查及诊断，请检查及诊断，请详详细填写本申请表细填写本申请表； Bar Code 条 形码粘贴条 形码粘贴处处 第一联 检验中心联 第二联 送检医院联 l 谢谢！CobasCobas 高灵敏度乙肝：20 IU/mL准确判断治疗起点准确判断治疗起点/ /终点终点线性范围线性范围乙肝：乙肝：20-1.720-1.710108 8 IU/mLIU/mL极佳的重复性，结果可靠极佳的重复性，结果可靠正确指导抗病毒

21、治疗正确指导抗病毒治疗每批试剂均使用每批试剂均使用WHOWHO标准品校准标准品校准保证定量结果的准确性保证定量结果的准确性和可溯源性和可溯源性每个样本使用同每个样本使用同源性内标定量源性内标定量避免结果不准确避免结果不准确采用采用AmpEraseAmpErase酶酶减少交叉污染减少交叉污染目前在目前在国内唯一国内唯一满足治疗指南和专家共识的满足治疗指南和专家共识的HBV HBV DNADNA和和 HCV RNAHCV RNA检测试剂检测试剂P P区耐药位点检测区耐药位点检测HBVHBV病毒耐药性检测病毒耐药性检测长期使用抗病毒药物可引起HBV耐药，引起耐药的基因突变位点主要集中于P区 原因：抗

22、病毒药物作用在病毒P区药物靶点上，引起相关基因变异，使得药物与相关靶点作用下降，进而产生耐药。抗病毒治疗后抗病毒治疗后HBV从病毒变异到临床耐药从病毒变异到临床耐药 拉米夫定 M204I/V L180M V173L 恩曲他滨 V173L L180M M204I/V 阿德福韦 A181V N236T 恩替卡韦 T184A（G/I/S) M250V 特比夫定 M204I/V常用抗病毒药物的耐药位点专用申请单专用申请单病程，病史病程，病史目前用药情况，服目前用药情况，服药时间药时间 肝 炎肝 炎 分 子 诊 断 综 合 检 查 申 请 单分 子 诊 断 综 合 检 查 申 请 单 姓名 必填 性别（必填） 男 / 女 年龄 必填 门诊号 科别 住院号 病房 床号 送检医院 送检医生 必填 医生联系电话 必填 采集时间（必填） 年 月 日 时 送检时间（必填） 年 月 日 时 临床印象：临床印象： 乙肝 丙肝 混合性肝炎 肝硬化 肝癌 肝纤维化 现病史现病史（临床表现以及病程） 抗病毒药物使用情况： 拉米夫定(贺普丁)_ 年 月至_ 年 月 阿德福韦(贺维力)_ 年 月至_ 年 月 恩替卡韦_ 年 月至_ 年 月 替比夫定_ 年 月至_ 年 月 替诺福韦_年 月至_ 年 月 干扰素_ 年 月至_ 年 月 恩曲他滨_年 月至_ 年 月 检测项目（注意：请在要检测