食品冰温贮藏中微生物污染及食源性致病菌的快速检测技术

1、2008年6月第29卷第6期食品研究与开发基金项目:天津市自然科学基金(05Y FJ M J C06100作者简介:王素英(1964-,女(汉,教授,博士,研究方向:食品微生物。食品冰温贮藏中微生物污染及食源性致病菌的快速检测技术王素英,申江(天津商业大学,天津300134摘要:阐述了冰温条件下食品中不同类型微生物数量的变化情况,提出冰温贮藏中潜在的食品不安全因素主要是食源性病原微生物的观点,并介绍了快速检测和鉴定食源性病原微生物的分子生物学技术。关键词:冰温;食品;贮藏;微生物MICROBIOLOGICAL CONTAMINATION AND THE RAPID TECHNIQUES FOR

2、 DETECTING AND IDETIFYINGPATHOGENS IN THE CONTROLLED FREEZING-POINT STORAGE FOODWANG Su-ying,SHENG Jiang(Tianjin University of Commerce,Tianjin 300134,China Abstract :The quantitative changes of various microbes at controlled freezing-point are expounded,and a new view is advanced that the main dang

3、erous factor is pathogens oriented from food under this storage technology.The rapid techniques for detecting and identifying the pathogens are presented.Key words:ice-temperature;food;storage;microorganism 近年来,随着国家经济的发展和人民生活水平的提高,消费者更多关注的是食品的质量与安全,因此,在食品生产和流通过程中,不仅要求食品原料无污染、无病害,而且在食品加工、贮藏、运输、分销和零售等

4、环节中,也必须创造条件以防治污染和降低损耗。食品冷链就是一种使上述各个环节的产品始终处于必须的低温环境下的特殊供应链系统。这种低温环境常以温度为基准分为3个层次,即0以上温度通常为010的冷藏,主要适用于有生命活动的果蔬贮藏,0以下通常为-18以下的冻藏,主要适用于无生命的加工食品的贮藏,以及0以下、食品冻结点以上温度带的冰温贮藏。冰温贮藏源于上个世纪70年代,是目前得到广泛研究和应用的一种新兴食品保鲜技术,是继冷藏、冷冻之后的第三代低温食品保藏技术,尤其对于有生命活动的食品,其显著的优点是能够长期有效地保持食品固有的风味、口感和新鲜度,既满足了消费者对食品的品质要求,又能够相对长时间的防治食

5、品的腐败变质,因此许多学者认为该技术是农产品贮藏保鲜的一次历史性革命1。冰温贮藏的温度远远高于冻藏,不能完全抑制微生物的生长繁殖,这些微生物的存活和繁殖是冰温贮藏食品不安全的主要因素,本文阐述温度与微生物生长的关系,总结分析微生物的各种快速检测方法,为冰温贮藏工艺的建立和完善提供参考。1温度与微生物生长1.1微生物的温度类型微生物是个体微小、结构简单、进化地位较低的一类生物的总称,与高等动植物相比,具有繁殖快、易变异、种类多、分布广等特点,人们常用“无处不在”解释微生物广泛分布的真正含义。特别是近年来,随着微生物生态研究技术的发展,从低温冰川到300高温的深海火山口均发现了微生物的存在,为方便

6、起见,人们根据生长的最适温度将微生物分为嗜冷、兼性嗜冷、嗜温、嗜热和超嗜热等不同类型,它们的最高、最适、最低生长温度和主要分布场所见表1。嗜冷微生物存在于南北极、冰川等极端低温环境中,由于地理隔离,它们污染食品冷链各个环节的几率较小。而农产品本身携带的嗜温微生物,以及在加工、质量安全1612008年6月第29卷第6期食品研究与开发运输过程中污染的嗜温微生物如果长期处于温度较低的环境中,则非常容易因生理适应忍受低温环境,逐渐成为兼性嗜冷或耐冷微生物2,人们常统称为低温微生物,是低温人工环境条件中容易生长繁殖而成为优势的微生物种类,低温微生物的非致病种类大量繁殖造成冰温食品腐败变质,而致病种类则具

7、有潜在的致病性。1.2低温贮藏对微生物的影响冰温条件能否很好地抑制微生物,尤其是细菌的生长繁殖,是冰温技术能否成功应用于食品贮藏的一个关键,许多学者考察了各种贮藏方式下细菌的繁殖情况,有代表性的研究结果如图1和图2所示3。 从图1可以看出,对于食品卫生常检测的指标大肠杆菌和葡萄球菌而言,冻藏是最好的贮藏条件,在储藏期间,尤其是贮藏的开始阶段,两种细菌的数量急剧下降,而在冷藏条件下,大肠杆菌的数量虽有大幅度的下降,但仍维持了一个较高的稳定水平,葡萄球菌数量则在整个贮藏期间数量基本稳定高的水平。冰温贮藏期间,大肠杆菌和葡萄球菌的数量变化与冷冻贮藏基本一致,说明冰温能够有效的抑制肠道微生物和室温微生

8、物的生长繁殖,能够有效防治因微生物的繁殖而引起的食品腐败变质。图2表示了鱼干在3种贮藏环境中的微生物的繁殖情况,冷藏时,细菌、真菌和低温菌繁殖速度快,两周内达到108个/g109个/g ,而冰温贮藏和冷冻贮藏基本一致,各类微生物在贮藏期间的数量基本维持在一个水平,由此可见,冰温和冻藏一样能够达到有效抑制微生物生长的目的。分析上述研究结果可以发现:冰温仅有抑制微生物生长的作用,而不具备杀菌的功能,食品中的低温微生物数量在冰温条件下仍然很高(104个/g 食品106个/g 食品,虽然在一定时间内不能造成食品腐败变质,但一旦存在病原微生物,潜在的危险性更大。因此,发展病原微生物快速检测技术,随时跟踪

9、贮藏期间病原微生物的有无,是保证贮藏食品安全的关键。2食源性致病菌的快速检测2.1发展快速检测技术的必要性根据致病的主要因素,食源性致病菌主要可以分为两类,一类是消化道传染病,主要是由食入的细菌在肠道内大量繁殖造成,一类是毒素性食物中毒,主要由产毒霉菌或细菌产生的毒素而引起。由于食源性致病菌对人体的危害性很大,故国家食品卫生指标规定,在任何食品中不得有病原微生物检出,同时规定了不同病原微生物的检测方法,国标中经典的检测方法都是通过选择性培养而实现,不仅检测步骤繁琐,检测时间长,而且培养温度一般是室温28或体温374,这样的检测条件往往漏检不可培养微生物和在所规定的条件下不能生长的微生物。由此看

10、来,这些方法既不能微生物类型The type of microorganisms嗜冷微生物Psychrotrophic microorganisms兼性嗜冷微生物Facultative psychrotrophic microorganisms 嗜温微生物Mesophilic microorganisms 嗜热微生物Thermophilic microorganisms 超嗜热微生物Ultra-thermophilic microorganisms表1不同类型微生物的生长温度与生态分布Table 1Growth temperature and ecological distribution o

11、f various microorganisms 主要分布Main distribution 南北极、冰川等人工冷环境陆地、水体、动植物体表、体腔人工高温环境火山口最低0以下015204565最适152030204555658090最高203545以上80100以上生长温度/Growth temperature/质量安全1622008年6月第29卷第6期食品研究与开发适应现场检测、在线检测等快速检测的需要,更无法满足低温贮藏中低温致病微生物检出的要求。近10多年来,分子生物学技术的日益发展,促进了病原微生物快速检测技术的进步,省却了传统方法的分离培养过程,大大缩短了检测时间,其中具有工业化应用

12、潜力的是以核酸检测为依据发展的技术。2.2以核酸分析为核心的快速检测技术不同种类的病原微生物,其遗传背景即脱氧核糖核酸(DNA,以及由DNA转录形成的核糖核酸(RNA不同,使我们根据DNA或RNA的差异进行物种鉴定成为可能,由此建立的检测方法也很多,主要包括探针杂交、聚合酶链式反应(PCR和基因芯片。2.2.1探针杂交核酸探针是被同位素或化学发光物质标记的一小段DNA或RNA,可以采用克隆或化学合成的方法获得,是某种微生物区别于近缘种类的特有核酸序列,它可以与环境中未知微生物的基因组DNA进行杂交反应,阳性杂交结果的出现就证明特定微生物的存在。早期的同位素探针,因放射性而不利于实验室安全,且发

13、射自显影的检测灵敏度也较低,随着样品前处理技术的发展,新型标记物质和检测技术的出现,目前主要利用液相杂交通过化学发光或比色法进行检测。2.2.2聚合酶链式反应(PCRPCR是一种灵敏度很高的反应,理论上可以检测到单个DNA拷贝。利用PCR来鉴定环境中特异性微生物主要依赖于被鉴定者所在分类单元种类之间的不一致性及与其它分类单元之间的遗传距离。以食源性致病微生物鉴定为目的的PCR,靶基因的选择非常重要,通常选择特异的毒力基因,如病原性小肠结肠炎耶而森菌存在于质粒上的pYV毒力因子基因,布鲁氏菌的IS711、沙门氏菌的IS200和弯曲杆菌的Flagellim基因5。存在于食品中的少数致病菌,通过其毒

14、力基因的PCR扩增,该DNA片段被扩大了10亿倍以上,很容易采用琼脂糖电泳的方法检测。PCR扩增是一个酶促反应过程,很容易受到被检食品中各种化学成分的干扰,因此伴随PCR技术的应用,食品样品的制备和前增菌液的研究也得到了长足的发展,所以该技术得到了广泛的应用。并在上述常规定性PCR基础上,发展了定量PCR技术,既能检测样品中致病微生物的种类,又能对各个种类进行定量的测定。2.2.3基因芯片基因组研究计划的实施,带动了生命科学研究的革命,基因芯片就是在多种微生物基因组序列被确定之后出现的一种新兴检测技术。这种技术利用从食品微生物中扩增到的序列标记荧光作为探针,与固定在玻片上成千上万的已知DNA序

15、列(主要是细菌进行杂交,结果可以通过直接的荧光扫描或酶学方法进行测定。由于在一个芯片上囊括了众多的已知菌序列,故可以同时鉴定检测样品中的多种细菌。另外,对于一种致病微生物而言,往往有多个与毒力有关的基因被固定在芯片上,这样确保了鉴定结果的准确性,如大肠杆菌O157H7毒性菌株的slt-和slt-基因、eae基因、rfbE基因和fliC基因可同时被芯片制造商固定在一个芯片上,只有同时出现阳性结果时,才能报告被检样品中存在大肠杆菌6。探针杂交、PCR反应和基因芯片技术均是近年来发展的新技术,理论依据充分,但因高灵敏度而对样品制备的过程提出了更高的要求,同时在实际应用中也极易受到反应环境中其它化学物

16、质和反应条件的影响,但随着研究的深入,这些技术必将在食源性致病微生物检测和鉴定方面替代经典方法。3结语冰温贮藏是保存食品原有风味、口感和新鲜度的有效方法之一,它的诞生和发展为调节食品结构、满足人们消费需求起到了重要的作用,同时也为降低农产品损耗、增加农民收入拓宽了途径。推进冰温技术在中国的应用,必须使广大消费者认识和接受冰温保藏食品,因此,冰温贮藏不仅要获得优质食品,更要获得安全食品,这给在冰温条件下食品质量与安全控制领域提出了许多新的研究课题。参考文献:1刘志鸣,万金庆,王建民.日本冰温技术发展史略J.制冷与空调,2005(9:70-742Chattopadhyay M K,Jagannad

17、ham M V.A branched chain fatty acidpromotes cold adaptation in bacteriaJ.J food protection,1999,62: 526-5313石文星,邵双全,李先庭,等.冰温技术在食品贮藏中的应用J.食品工业科技,2002,23(4:64-664国家标准委员会.食品卫生微生物学检验方法GB/T4789.1-1935S.北京:科学出版社,2002-20035Medicid D E,Crocil F,Delibato E,et al.Evaluation of DNA extrac-tion methods for use in combination with SYBR greenreal-time PCR to detect Salmonella enterica