一种适用于PCR的土壤微生物DNA的提取方法_图文

1、一种适用于PCR 的土壤微生物DNA 的提取方法李惠敏,胡雪英,秦新民3(广西师范大学生命科学学院,广西桂林541004摘要目的对土壤微生物的DNA 进行提取,以建立一种适用于PCR 技术分析的土壤微生物DNA 的快速提取方法。方法采用了2种不同的直接裂解法提取土壤微生物DNA,并用细菌通用引物27F 和1492R 进行PCR 扩增16S r DNA 片段。结果2种方法提取的土壤微生物总DNA 电泳结果显示没有差别,但是只有CT AB 、溶菌酶、冻融裂解法提取的总DNA 不需要纯化,在增加Mg 2+用量的条件下,只需用第一轮非特异PCR 产物作为模板即可扩增出16S r DNA 片段。结论CT

2、 AB 、溶菌酶、冻融裂解法提取土壤DNA,方法操作简单、快捷,同时适用于PCR 分析,为土壤微生物群落结构的多样性分析奠定了基础。关键词土壤微生物DNA;提取;PCR;16S r DNA 中图分类号S154.34文献标识码A 文章编号0517-6611(201002-00600-02An Extracti on M ethod of So il M icrobi a l D NA for PCR Ana lysisL I Hui 2m i n et a l (College of L ife Science,Guangxi Nor mal University,Guilin,Guangxi

3、541004Abstract Objective The ai m of this study was t o extract DNA from s oil m icr oorganis m s and establish the rap id extraction method of s oil m i 2cr obial DNA for PCR analysis .Method T wo kinds of different direct pyr olysis methodswere investigated .16S r DNA was amp lified with bacterial

4、 universal p ri m ers 27F and 1492R by PCR.ResultThe electrophoresis results of total DNA fr om s oil m icroorganis m s by t w o kinds of DNA ex 2traction methods had no difference .W ithout purification of T otal DNA extracted by CT AB,lys ozy me,freezing thaw pyrolysis method,the first 2cyclenon 2

5、s pecific PCR products could be used as the temp late to amp lify 16S r DNA frag ments under the conditi ons of adding Mg 2+amount .Conclu 2si on S oil DNA could extracted by CT AB,lys ozy me,freezing thaw pyrolysis method .The method was si m p le and fast in operation,suitable for PCR analysis .Th

6、e research p r ovided the basis for the diversity analysis of s oil m icrobial communities .Key words Soil m icrobial DNA;Extracti on;PCR;16S r DNA基金项目广西师范大学第三批青年骨干教师资助计划(2007。作者简介李惠敏(1978-,女,广西北流人,硕士,讲师,从事分子生物学的教学与研究工作。3通讯作者。收稿日期2009209207土壤是微生物栖居的主要场所,微生物在土壤中的分布及生命活动与土壤肥力、植物营养、植物病害和植被状况等密切相关。因此,研究

7、土壤微生物群落和多样性对有机物的形成和分解、土壤监测与生态环境改善等方面有着重要的意义。现在广泛公认在环境样品中只有0.001%15.000%的微生物具有可培养性,其中土壤约为0.300%,活性污泥约为1.000%15.000%1。因此,利用传统微生物学分离纯化培养的方法来检测环境样品中的微生物会极大地低估样品中微生物的多样性。随着分子生物学的理论与技术在微生物生态学研究中的不断渗透,微生物多样性的研究有了新的突破。而以16Sr RNA 序列分析作为微生物分类系统的主要依据也得到了广泛认同2。由于土壤的理化成分复杂,在提取的过程中含有较多的抑制成分,如腐殖酸、酚类化合物、重金属离子等,其中又以

8、腐殖酸和腐殖酸类似物的抑制作用最明显,它们主要通过干扰裂解、使核酸降解或非特异性吸附和抑制酶活性的方式起作用。总之,从土壤环境中高效地获得微生物基因组DNA 具有相当的难度,所提取DNA 的质量将在很大程度上影响后续的PCR 、酶切等的研究工作3-4。因此,无论是土壤宏基因组文库的构建还是土壤微生物的分子生态学研究,提取土壤微生物基因组DNA 是研究开始的关键。1材料与方法1.1试验材料1.1.1DNA 提取材料。DNA 提取材料的采样地点位于广西师范大学植物园。采样地点的土地利用类型为菜地,种植小白菜。采样时间是2008年11月,采集菜地中表层的土壤,采集深度为010c m,用塑料袋封装带回

9、,密封在-20下保存。1.1.2试剂与仪器。TE NP 缓冲液(pH 值8.0:50mmol/L Tris,20mmol/L E DT A,100mmol/L NaCl,1%(W /V P VP 。DNA 提取液(pH 值8.0:100mmol/L Tris,100mmol/L E D 2T A,200mmol/L NaCl,2%(W /V P VP,2%(W /V CT AB 。DNA 提取液(pH 值8.0:100mmol/L Tris,100mmol/L E D 2T A,100mmol/L 磷酸钠,1.5mol/L NaCl,1%CT AB,2%CaCl 2,1g/m l BS A 。

10、Sig maK 238高速冷冻离心机;G L 220G 2型高速冷冻离心机;FR 2980生物电泳图象分析系统(上海复日;HH 2S 恒温水浴锅;DYY 25型稳压稳流电泳仪;PCR 扩增仪(App lied B i 2osyste m s 。1.2试验方法1.2.1土壤微生物DNA 的提取。1.2.1.1玻璃珠、溶菌酶和S DS 裂解法。参照李长林等的方法略有改动5:取0.5g 土壤置于灭过菌的2m l 离心管中,加入1.5m l TE NP buffer,1000r/m in 离心5m in,弃上清液,取沉淀。加入0.2g 直径约1mm 的玻璃珠和0.6m lDNA 提取液,旋涡振荡10m

11、 in 。加入50l 溶菌酶(100mg/m l ,充分混匀,37水浴2h,期间颠倒离心管4次。加入0.5m l 2%的S DS 缓冲液,68水浴40m in,隔10m in 颠倒离心管1次。1000r/m in 离心10m in,取上清液。在上清液中加入等体积的氯仿/异戊醇(241,颠倒混匀,静置10m in 。10000r/m in 离心15m in,收集上清液。在上清液中加入0.5倍体积25%PEG6000,4放置过夜,12000r/m in 离心10m in,沉淀用70%乙醇洗涤,8000r/m in 离心5m in,沉淀室温晾干,溶于30l 双蒸水中,备用。1.2.1.2CT AB

12、、溶菌酶和冻融裂解法。参照李钧敏等的方法略有改动6:取土壤样品0.5g,置于灭过菌的2m l 的离心管中,加入1.3m l 12%(W /V 磷酸钠,高强度旋涡振荡10m in 。10000r/m in 离心5m in,取沉淀,再次加入1.0m l 12%磷酸钠洗涤,混匀。10000r/m in 离心5m in,取沉淀,再次加责任编辑李菲菲责任校对傅真治安徽农业科学,Journal of Anhui Agri .Sci .2010,38(2:600-601,619入0.8m l12%磷酸钠洗涤,混匀。10000r/m in离心5m in,取沉淀。加入DNA提取缓冲液,混匀,再加入50l溶菌酶(

13、100mg/m l颠倒混匀,37水浴1h。65水浴1h,中间反复冻融3次。10000r/m in离心10m in,取上清。加入等体积的氯仿/异戊醇抽提,12000r/m in离心10m in,取上清。DNA的沉淀同“1.2.1.2”的PEG6000法进行沉淀。1.2.2DNA质量检测。1.2.2.1电泳检测总DNA质量。琼脂糖凝胶电泳初步检测总DNA质量7,经电泳分离且染色后的凝胶直接在复日科技FR2200生物电泳图像分析系统上拍照并分析所提取DNA的质量。1.2.2.216S r DNA的PCR扩增。用于扩增16S r DNA基因的细菌通用引物:27F(52AG AGTTTG AT CCTG

14、G CT CAG23和1492R(52T ACCTTGTT ACG ACTT234,由上海捷瑞生物工程有限公司合成。以广西师范大学生命科学学院实验室平板培养的大肠杆菌单菌落直接作为PCR反应的DNA模板,建立16S r DNA的扩增反应体系。模板DNA(从平板上挑取大肠杆菌单菌落,Taq DNA聚合酶0.5l(2.5U,10×PCR 缓冲液2.5l,d NTP(each20mmol/L0.5l,引物27F和引物1492R各0.5l,补水至25.0l。PCR反应循环参数5: 94预变性5m in,然后94变性44s,57退火60s,72延伸2m in,30个循环,最后72保温5m in

15、。扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳,对E B染色后的凝胶进行凝胶成像系统扫描后分析其扩增产物。为了得到较好的PCR结果,笔者对PCR反应成分包括Taq酶、BS A和Mg2+的用量等进行了不同的组合,以优化PCR反应条件。2结果与分析2.1土壤D NA的提取结果以采集的土壤为材料,2种方法所得的土壤DNA的提取结果经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,结果见图1。图1显示,所提总DNA的电泳条带较完整,拖带现象不是很明显,且DNA长度大于21kb,在提取过程中无明显降解和被剪切的现象。结合试验过程中的具体操作,使用玻璃珠、溶菌酶和S DS裂解法提取总DNA时,土壤的预处理比较简单,但所用时间比较长

16、,在离心去除杂质过程中,经常会出现沉淀为棕黄色,所得DNA含杂质较多。采用CT AB、溶菌酶和冻融裂解法时,土壤的预处理所用时间也较长,但所得DNA含杂质相对较少。2.216S r D NA的PCR扩增结果从图2可以看出,用这2种不同的方法所获得的DNA不经过处理直接用于PCR反应,即使额外地增加Mg2+或者同时增加Mg2+和BS A也无法扩增出16S r DNA。说明提取的DNA中可能含有污染物质腐殖酸,它鳌合了Mg2+或是和DNA或蛋白质发生结合,抑制了Taq DNA聚合酶的活性。而取1.02.0l第1次PCR 后的产物为模板进行PCR反应,结果显示,以CT AB、溶菌酶和冻融裂解法提取的

17、DNA为模板经2次PCR以后与直接用细菌扩增的结果是一致的,而且提取的DNA不需经过纯化,只需进一步稀释和加入额外的Mg2+即可扩增出16S r DNA (图2泳道CD。而以玻璃珠、溶菌酶和S DS裂解法提取的DNA经过同样的处理也无法扩增出16S r DNA(图2泳道EF。虽然以CT AB、溶菌酶和冻融裂解法提取的总DNA为模板第1次PCR并没有特异性扩增产物,而以此产物2.0l 为模板,在PCR缓冲液中已含有Mg2+的情况下,在20.0l 反应体积中再加入2.0l的Mg2+量进行PCR即可得到预期大小的16S r DNA 的特异条带。注:泳道M为DNA Marker(DNA/Eco R I

18、+Hin dIII;泳道AB 为玻璃珠、溶菌酶和S DS裂解法提取的总DNA;泳道CD为CT AB、溶菌酶和冻融裂解法提取的总DNA。Note:Lane M.DNA Marker(DNA/Eco R I+Hin d III;Lane A-B.T otal DNA extracted by glass beads2lys ozy me2S DS pyr olysismethod;Lane C-D.T otal DNA extracted by CT AB2lys ozy me2freezing tha w pyr olysis method.图1总D NA的电泳图谱F i g.1The elec

19、trophoretogram of tot a l D NA注:泳道M为DNA Marker(DL2000;泳道AB的PCR反应模板为大肠杆菌菌落;泳道CD为CT AB法的PCR结果;泳道EF为S DS法的PCR结果。Note:Lane M.DL2000DNA Marker;Lane A-B.E.coli col onies as DNA te mplate in PCR;Lane C-D.PCR a mp lificati on re2sults of DNA by CT AB method;Lane E-F.PCR a mplificati onresults of DNA by CT A

20、B method.图216S r D NA的PCR产物电泳图谱F i g.2The electrophoretogram of PCR products of16S r D NA3讨论从土壤中直接裂解微生物以获取总微生物DNA与从土壤中先分离微生物再提取DNA相比较,其优势明显在于微生物种类丢失较少;然而其不足之处在于这样得到的DNA 往往含有较多影响后续研究如PCR反应的腐殖质等杂质。在进行PCR扩增时,DNA的量少至10-12pg就可以进行扩增,但只要有微量腐殖酸或其类似物存在就会抑制PCR扩增3,因此,去除腐殖质等是PCR反应的一个关键所在。该研究中,2种土壤DNA的提取方法所得总DNA

21、质量在电泳图谱上并没有根本性区别,然而PCR的结果却完全不同。(下转第619页10638卷2期李惠敏等一种适用于PCR的土壤微生物DNA的提取方法报道。体胚诱导率低,且畸形体胚多。生根率低、生根质量不高。根从苗基部的愈伤组织产生,使根与茎中间形成离层,缺乏疏导组织的联系,影响下一步的移栽工作。试管苗移栽不能成活,主要原因为:生根质量不高;移栽时期或者环境条件不适宜;组培苗生根后发生休眠。总之,由于上述原因,芍药的组织培养技术还未能在生产上推广和应用,相关难题还有待进一步研究。参考文献1李嘉钰.中国牡丹与芍药M.北京:中国林业出版社,1999.2秦魁杰.芍药M.北京:中国林业出版社,2004.3

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