宏基因组学在微生物活性物质筛选中的应用

1、=收稿日期2010-04-09=基金项目国家高技术研究与发展计划(863项目(2003AA62040;广东省科技计划项目(2007B011000007;南海水产研究所中央公益性科研院所基本科研业务费专项(2010TS01;中国科学院海洋生物资源可持续利用重点实验室、广东省应用生物学重点实验室和广东省海洋药物重点实验室联合开放课题(L M B081008=作者简介丁贤(1972-,男,博士生,从事微生物生化及其活性代谢物研究、免疫刺激剂开发等研究,Em ai:l dxybhot m ai.l co m;周世宁,通讯作者,教授,博士生导师,Em ai:l lsszsl m ai.l sysu 文章

2、编号:1005-376X(201006-0565-05=综 述宏基因组学在微生物活性物质筛选中的应用丁贤1,2,殷波3,李慧贤2,杜纪坤2,周世宁2(1.中国水产科学研究院南海水产研究所,广东广州 510300;2.中山大学生命科学院有害生物控制与资源利用国家重点实验室,广东广州 510275;3.中科院南海海洋研究所,广东广州 510301=摘要 采用传统分离培养筛选微生物新活性物质的方法受到很大制约,自然界99%以上的微生物不能培养,其资源开发受到很大限制。环境微生物宏基因组技术应用避开了微生物分离纯培养问题,极大拓展了微生物资源的利用空间,增加获得新活性物质的机会和途径。本文着重介绍宏基

3、因组的概念、研究策略包括DNA 提取、文库构建与筛选等及在微生物活性物质筛选中的应用,并对宏基因组研究中存在的问题进行探讨。=关键词 宏基因组;未培养微生物;活性物质;筛选=中图分类号Q 93 =文献标识码AAdvance in the study of screening bioactive co mpounds fro m m icrobe by m etageno m-ic library m et hodDING X i a n 1,2,Y IN Bo 3,LIH u-i x ian 2,DU J-i kun2,ZHOU Sh-i n i n g2(1.South China Sea

4、F isheries R eseach Instit ute of CAFS,Guangzhou 510300,China ;2.S t ate K e y Labora t ory of B iocontro l ,S c hool of L i fe Science ,Sun Yat -sen University,Guangzhou 510275,China;3.Sout h Ch i na Sea Instit u te of O ceano logy,Chi -nese A cade my of Science ,Guangzhou 510301,China =Ab stract I

5、t i s reported tha tm ore than 99%m icrobe species w ere non -cultured o r un -cu lt ured by t he trad iti ona lcu lti vation approach ,wh ich li m its d i scover i ng novel biocata l ysts(enzym esand bioacti ve co m pounds from m i croorgan i s m s .M etageno m ic li brary m ethod is a new or i ent

6、ation of the develop m ent of gene tic eng i nee ri ng and study i ng uncu ltured m icroor -g an i s m s .M etageno m e li braries w ere constructed w it h DNA ex tracted direc tly fro m sa m ples and transf o r m ed to appropr iate host .T he li brar i es w ere screened in d ifferent strateg i es s

7、uch as sequence -driven or f uncti on -dr i ven sc reeni ngs for d ifferent nove l b i ocata l y sts (enzy m esand b i oactive co m pounds or i nteresting g enes re lated to t he ir synt hases .T hen ,it prov i des anew stra tegy for seeki ng nove l b i oactive com pounds and has a m plifi ed the sp

8、ace that m icrobe resource can be u tilized ,and enhances the oppo rt unity o f dicove ri ng nove l b i oac tive substances .T he notion and m ethods o f study i n m etagenom e ,i nclu -d i ng DNA ex tracti ng ,librar ies construc tion and screening w ere i ntroduced i n this paper .=K ey w ords M e

9、tageno m e ;U n -cultured m icroo rganis m s ;B i oactive compounds ;Screening自从微生物被发现以来,其在治疗人类疾病和造福人类方面所发挥的重大作用及其具有的影响力促使微生物学家在研发微生物及其合成的生物活性物质上倾注了极大的精力,遵循传统的研发途径分离纯培养了许多微生物特别是土壤微生物菌株,开发了临床上得到广泛应用的多种抗生素、抗肿瘤药物、免疫调节剂和酶抑制剂等活性物质1,2。微生物提供的脂肽、脂蛋白、脂多糖和核酸工具酶等也已广泛应用于化工业、食品业和基因工程等领域。然而,日益积累和不断深入的研究表明,用传统方法研发

10、筛选上述生物活性物质时,重复发现率高,重复投入劳动。所以,为了开发新活性物质,人们尽可能从极端环境中收集样品,以期从中找到能合成新活性物质的微生物,但收效甚微。因此,研究方法的改进和创新成为迫切解决的问题。日用丰富的分子微生物生态学研究表明,海洋环境中存在大量未能培养微生物,约为总量的99%。但对环境微生物多样性缺乏认识和开发新活性物质的新技术和手段尚不具备。基于这一现实需求,认识微生物世界就成为十分必要和迫切,而宏基因组(m etagenome 的提出适应了这一研究技术创新的需要,开创了一个全新的微生物学研究方法,环境微生物因此而成为主要的研究和开发微生物资源的对象3。微生物学研究方法的巨大

11、变革改变了很多微生物学家关于微生物和怎样去研究微生物的观点,激发了微生物研究方法上的一次革命。其变革的支撑点就是基于这样一个事实即未培养微生物的规模远大于可培养的种类并且拥有研究这个未知世界的方法4。利用宏基因组首次通过异源基因组和相关环境的演化分析表明,微生物多样性的复杂程度远远大于传统方法得出的结论,筛选出具有潜在工业开发价值的酶或活性物质58。在本综述中,将宏基因组的研究流程、宏基因组文库的构建与筛选及其在微生物活性物质筛选中的应用等进行总结,并探讨一些存在的问题。1 宏基因组及其研究流程/M etageno m e 0由HANDELS MAN 等9(1998最先提出,其定义为/the

12、geno m es of the tota l m icrob i o ta f ound i n nature 0,即特定环境境中全部微生物遗传物质的总和。国内学者将其译为/宏基因组0,文献中有/co ll ective genome 0、/env iron m en -ta l genom e 0等写法,现已基本统一采用/M etageno m e 0,主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和,包含可培养与未培养微生物的基因。由于不必经过微生物分离培养环节而避开了微生物单纯分离培养问题,极大拓宽了微生物资源的利用空间,增加获得新活性物质的机会和途径10。宏基因组学常用研究开发流程见图1。

13、图1 宏基因组学研究开发流程2 宏基因组文库构建与研究策略宏基因组本质上是对一些相似但不相同因素的集合进行分析,是一种不依赖于人工培养的微生物基因组分析技术,它与群落基因组、环境基因组和种群基因组在研究方法上都有相似之处。其以微生物基因组学的迅速发展和聚合酶链式反应的广泛应用为基础,是统计学的理念在基因组学中的体现和应用。其目的将直接从环境中提取的基因组DNA (eDNA 克隆到适当载体上,构建宏基因组文库。最后运用不同的分析方法和手段筛选和分离感兴趣的基因,通过基因测序,推测活性产物结构,建立系统发生树等。宏基因组的研究方法理论上可以获得环境样品中所有微生物的基因组序列和活性产物的整个操纵子

14、(O perons,为研究原核生物次生代谢产物的合成基因、调控基因及其调控机制等提供可行的技术路线,为活性产物的大量异源表达及其生物合成提供有力的手段。PACE 等(1985提出将环境样品DNA 直接进行克隆的设想,而直到1991年才有SCHM I DT 等利用噬菌体作为载体进行直接克隆成功的报道。宏基因组通常的研究思路包括环境样品总DNA 提取、构建宏基因组文库、筛选感兴趣的目的基因、功能基因表达和产物的分子生化鉴定等。2.1 样品总DNA 提取 宏基因组分析从分离提取环境样品DNA 开始,提取DNA 的质量直接影响文库的构建和后续文库筛选。CENDR I N 等(1993和GARBOR 等

15、(2003研究表明,样品中存在的杂质影响如腐殖酸类、金属离子和多糖等物质对核酸提取过程影响很大,必须去除,否则分子克隆操作过程中多种酶的活性会受到影响甚至被强烈抑制。因此,获得高纯度、高分子量、高浓度的环境样品总DNA 是宏基因组文库构建的关键之一,需要尽可能地完全抽提出样品中总DNA 和保持其较大片段以获得完整的目的基因或基因簇。目前,研究人员已经提出并建立了多种DNA 提取方法。在多种提取DNA 的草案11相继被提出过程中,TOR S V I K 等研究小组为宏基因组学这个领域奠定了基础。目前用于土壤或沉积物等环境样品DNA 的分离提取主要是原位(i n situ溶菌法和异位(ex s i

16、t u溶菌法13。原位溶菌法将环境样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理后抽提纯化,也称直接裂解法(D -i rect lysis extraction m ethod,适合用质粒(P l as m i ds或噬菌体(phage为载体克隆13。此法操作方便、成本较低、DNA 提取率高、偏差小,但由于机械剪切作用较强,导致所提取DNA 片段较小(150kb。FA EGR I 等(1977和TOR S V I K 等(1980采用异位溶菌法先分离黏附在土壤、沉积物等样品中的微生物细胞,再提取DNA,又称微生物细胞抽提法(Bacte -tia l ex tracti on m ethod。如采用尼可登介质密

17、度梯度离心法分离微生物细胞,然后包埋于低熔点琼脂糖中裂解,脉冲场凝胶电泳回收DNA,该法适合柯斯质粒(Co s m i ds或者细菌人工染色体(Bac teria l artificia l chromo so m e ,B A C为载体克隆,获得DNA 片段较大(20500kb,纯度高,但操作繁琐,成本较高,有些微生物在分离过程中可能丢失,甚至抽提不出一些细胞壁较厚的微生物DNA 。所以,在实验过程中采用哪一种实验方法取决于实验所要求的目的基因大小和研究目的。2.2 文库构建建过程中,载体是文库构建所必需的因素,而且在活性物质筛选是也发挥极其重要的作用。载体选择的原则主要考虑是否有利于目标基

18、因扩增、表达及在筛选细胞毒类物质时表达量的调控等。筛选目标物不同,其载体不同,筛选技术手段也有所不同。由于活性物质多是微生物的次生代谢物,其代谢途径由多基因调控。因此,有必要尽量插入大片段DNA 以获得完整的代谢途径多基因簇,以期达到预期目的。目前,多采用细菌人工染色体(BA C和粘粒(Cos m i d或Fos m i ds 载体。B A C 和Fos m i ds 载体文库自1992年引入后12,大大提高了基因组克隆的效率。M ICHELL 等构建了2个BAC 文库,包含超过1Gbp 的DNA,筛选和鉴定了几个阳性克隆,其所表达外源基因的表型包括脂肪酶活性、淀粉酶活性、抗菌活性及溶血活性。

19、S H IZUYA 等(1992研究表明用B A C 载体可插入片段和克隆能力较大(300kb ,但克隆效率低;用Fo s m i ds 载体可插入中等大小片段(3852kb克隆,克隆效率较高13,14。上述载体在宿主菌中的稳定性高,但拷贝数较低,不利于宏基因扩增,表达量也较低。为了提高宏基因表达和重组克隆子的活性检测,甚至可直接利用表达载体构建宏基因组文库。表达载体可插入的宏基因片段一般较小(1PELLI GRI N I A,T HOM AS U,W I LD P,et a.l Bact erici dal activities ofl ysozy m e and ap roti n i n

20、 agai n st gra m negati ve and gra m pos i ti ve b acteri rel ated to their bas i c characterJ.J App l B acteri o,l1992,72(3: 180-187.2GUNNAR H,I NGER O,Raknes a A,et a.l Preparative h i gh-perf or m-an ce li qu i d chro m atograph ic s eparati on and anal ys i s of the M alt aci ne co m plex-a fa m

21、 ily of cycli c p epti de anti b i oti cs fro m Ba cill u s subtilisJ.J C hro m atog B,2004,811(2:243-251.3LORENZ P,SCHLEPER C.M et ageno m ea challengi ng source ofen z ym e discoveryJ.J M olC at al B E nzy m,2002,19(2:13-19. 4P ACE N R.Open i ng t he door on t o t he nat u ralm icrob i alw orl d:m

22、o l ecu-l ar m icrob i al ecologyJ.H arvey L ect,1995-1996,91:59-78.5DI AZ-TORRES M L,M CNAB R,SPRATT D A,et a.l Novel tetracy-cli ne res i stan ce det er m i nant f ro m t h e oralm et ageno m eJ.An ti m icrob Agen ts C he m other,2003,47(4:1430-1432.6G I LLESPI E D E,BRAD Y S F,BETTER M ANN A D.Is

23、olati on of an t-ib i oti cs turbo m yci n A and B fro m a m etageno m ic li brary of soilm icrob i alDNAJ.A pp l Environ M icrob io,l2002,68(9:4301-4306.7KN I ETSCH A,BO W I EN S,WH I TED G,et a.l Iden tifi cati on and char-acteri zation of coen z y m e B12-dependen t glycero l dehyd ratase-and d i

24、 ol dehydratase-encod i ng gen es from m et ageno m ic DNA li b raries deri ved fro m enrichm ent cu lt uresJ.App l Env i ron M icrob io,l2003,69(6: 3048-3060.8LORENZ P,LI EBETON K,N I EHAUS K,et a.l Screening for novel en-zy m es f or b i ocatal yti c processes:acces s i ng t h e m etageno m e as a

25、 re-sou rce of novel f un cti onal sequen ce s paceJ.Cu rr Op i n B i otechno,l 2002,13(6:572-577.9HANDELS M AN J,RONDON M R,BRAD Y S F,et a1.M olecu l ar b i o-l ogical access to the che m i stry of unkn o w n soilm icrobes:a ne w fron tierf or nat u ral p roductsJ.C he m B i o,l1998,5(10:245-249.1

26、0RONDON M R,AUGUST P R,BETTER M ANN A D,et a.l C lon i ngt h e s o ilm etagen o m e:a s trat egy for access i ng t h e genetic and f unctionald i versity of un cu l tured m icroorgan is m sJ.Appl Env i ron M icrob i o,l2000,66(6:2541-2547.11KRSEK M,W ELL I NGTON E M.C o m paris on of d ifferent m et

27、 hod s fort h e isol ation and purifi cati on of t otal co mmun it y DNA from soilJ.J M icrob i olM et h ods,1999,39(1:1-16.12BE J A O.To BAC or n ot t o BAC:m ari ne ecogen o m icsJ.Cu rr O pi nB i otechno1,2004,15(3:187-190.13STEI N J L,M ARS H T L,WU K Y,et a1.Characteri zation of uncu lt-ivated

28、p rokaryotes:isol ati on and anal ysis of a40-k ilobase-p ai r geno m e frag m en t fro m a p l ank t onic mari n e archaeonJ.J Bacteri o,l1996,178(3:591-599.14BRADY S F,CHAO C J,HANDELSMAN J,et a.l C l on i ng and heter-ologous exp ress i on of a nat u ral product b i oayu t heti c gen e cl u ster

29、fro m eDNAJ.OrgLen,2001,3(13:1981-1984.15M ARTI NEZ A,KOLVEK S J,Y I P C L,et a1.Genetically m od ifi edbacteri al strai n s and novel bact eri al artifici al ch ro m oso m e s hu ttle vec-t ors f or con structi ng environm en tsl li braries and detecti ng heterol ogoua natural p roducts i n mu lti

30、p l e expression hostsJ.App l Environ M icro-b i o,l2004,70(4:2452.16M ARTI N J F.Ph osphate con trol of the b i osynthesis of an ti b i oti cs andother secondary m etabolites i s m ed i ated by the Pho R-PhoP s yste m:an un fi n is hed st oryJ.J Bacteri a,l2004,186(16:5197.17TANJ A W,STEPHANIE R,RO

31、LF D.Is o l ation and characterizati on ofm etall oproteas es w it h a novel do m ai n stru cture by construction and screen i ng ofm etageno m i c li b rariesJ.App lE nviron M i crob io,l2009, 75(8:2506-2516.18SARI KA S,F ARRAH G K,GHUL AM N.M ol ecu l ar clon i ng and char-acteriz ati on of a my l

32、 as e fro m soil m etagen o m ic li brary derived fro m N orthw estern H i m alayasJ.A pp l M i crob i o l B i otec hno,l2010,DO I10.1007/s00253-009-2404-y.19HUANG Y L,LA I X T,H E X C,et a.l Ch aracteriz ati on of a deep-seased i m entm etageno m ic cl one that p rodues w ater sol ub l e m elan i n

33、 i n E.coliJ.M ari ne B i otechno,l2009,11(1:124-131.20SCHLOSS P D,HANDELS M AN J.B i otec hno l og i cal pros p ects fro mm etageno m icsJ.Cu rr Op i n B i otechno,l2003,14(3:303-310. 21LILES M R,M SNAKE B F,B I NTR I M S B,et a1.A cen s us of r RNAgenes and li nk ed geno m i c s equ ences w it h i

34、 n a s o ilm et ageno m ic li brary J.App lE nviron M i crob i o,l2003,69(5:2684-2691.22FRI AS-LOPEZ J,S H I Y,TYSON G W,et a1.M i crob i a l co mmun it ygene express i on i n ocean surf ace w atersJ.P NAS,2008,105(10: 3805-3810.23VENTER J C,RE M I NGTON K,HE I DELBERG J F,et a1.E nviron-m en t a l

35、genom e s hot gun sequen ci ng of the Sargasso S eaJ.Science, 2004,304(2:66-74.24VOGET S,LEGGE W IE C,UESBECK A,et a1.Prospecti ng f or novelb iocatal ysts in a s o ilm et agenom eJ.App l Environ M i crob i o,l2003,69(10:6235-6242.25CRA I G VENTER J,KARI N R,J OHN F,et a1.Environm en talgeno m es ho

36、tgun sequenci ng of t he sargass o seaJ.S ci en ce,2004,304 (5667:66-74.26HENNE A,DAN I EL R,SEHM ITZ R A,et a1.Con strueti on of env-ironm entalDNA li brari es i n E sc h eri ehia coli and screen i ng f or the pres-en ce of genes conferri ng utili zation of4-hydroxybu tyrateJ.App lE n-viron M icrob

37、 i o,l1999,65(9:3901-3907.27KR UGERM,M EYERD I ERKS A,G I DCKNER F O,et aI.A con s p icu-ou s n ic k el protei n i n m i crob ialmats t h at oxidizem ethane anaerob i call y J.Nat u re,2003,426(6968:878-888.28LEE C M,YEO Y S,LEE J H,et a1.Id entifi cati on of a novel4-hyd roxyphenylpyruvate d i oxyg

38、enase fro m t he soilm et ageno m eJ.B i o-ch e m B i ophys Res Comm un,2008,370(2:322-326.29E SCHENFELDT W H,STOLS L,ROSENBAUM H,et a.l DNA fro muncu lt u red organ i s m s as a s ou rce of2,5-d i keto-D-gl ucon i c aci d redu c-t asesJ.Appl Environ M icrob i o,l2001,67(9:4206-4214.30GUPTA R,BEG Q

39、K,LORENZ P.Bact eri a l al k ali ne proteas es:m o-lecu l ar approaches and i ndu stri al appli cati on sJ.App lM i crob i ol B i o-techno,l2002,59(1:15-32.31HEALY F G,RAY R M,ALDR I CH H C,et a.l D irect i sol ati on off uncti onal genes en cod i ng cell u l as es fro m the m i crob ial consorti a

40、i n at h er m oph ilic,anaerob i c d i gesterm aintai ned on lignocell u l oseJ.A pp l M icrob i ol B i otechno,l1995,43(4:667-674.(上接第562页生6,促进肝细胞的再生,有利于肝功能的恢复。本实验表明整肠生通过调节肠道菌群的平衡,能够降低酒精性肝炎患者同型半胱氨酸水平,对酒精肝炎患者的肝功能恢复有积极的意义。=参考文献1曾民德,陆伦根.酒精性肝病的治疗J.胃肠病学和肝病学杂志,2000,9(3:164-168.2KALRA P K.H o m ocysti ne

41、and card i ovasc u lar d i seaseJ.C urr.Ather-oscl er Rep,2004,6(2:101-106.3BODE C,SCHAFER C,FUKU I H,et a.l E ffect of treat m en t w it h paro-m o m y C in on con troll d e trialJ.A lcohol C li n E xpres,2003,21(9: 1367-1373.4中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.酒精性肝病诊断标准J.中华肝脏病杂志,2003,11(2:72.5VAN CULDENER C,STAM F,TEROU W ER C D.Homocystei ne m e-t abolis m i n renal fail u reJ.K i dn ey I n t Supp,l2001,78:s234-s237.6M ENARD S,CANDALH C,BAM BOU J C,et a.l Lactic aci d bacteri as ecrete m etabolites ret a i n i ng ant-i i n fl a mm at ory