(药学论文)绿原酸的生物活性

1、本研究在以前研究的基础上进行中间试验,利用以下工艺流程从杜仲叶中制得绿原酸纯品:40%乙醇提取(80,2h,116料液比,提取2次)制备浸膏(真空浓缩,80鼓风干燥)加水转溶(4次)铅盐沉淀(每100g杜仲叶用140g乙酸铅)解析绿原酸(20%H2SO4)乙酸乙酯萃取(约20次)浓缩析出粗品重结晶得纯品,平均得率0.53%,纯度98.35%。研究中还发现杜仲叶中不含异绿原酸。杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)为杜仲科(Eucommiaceae)杜仲属植物,富含绿原酸。作者曾对影响杜仲叶中绿原酸提取率的各种因素进行了研究,得出了提取绿原酸的最佳工艺条件1。本研究在此基础上,利用所

2、得出的最佳工艺条件进行放大提取试验,用铅沉法对提取出的绿原酸进行分离,得到（通常用的最多的是第二种，即分配平衡，）色谱分离原理 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。 1液固色谱法 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度510m。适用于分离分子量2001000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。 2液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键

3、合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。 涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。 正相色谱法 采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性

4、的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。 反相色谱法 一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。 随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注

5、意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.57.5（28），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.510范围操作。 正相色谱法与反相色谱法比较表 正相色谱法 反相色谱法 固定相极性 高中 中低 流动相极性 低中 中高 组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出 从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。 3离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离

6、子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。 缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。 离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。 4离子对色谱法 又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使

7、其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。 分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。 分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。 离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入310 mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。 5排阻色谱法 固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，

8、直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。 采用反相高效液相色谱法测定解毒宣透汤中连翘苷、绿原酸、黄芩苷的含量。色谱柱：Hypersil-C18(5m，200×4.6mmI.D.)，连翘苷流动相为乙腈：水(21:79,V/V)，检测波长：277nm，平均回收率为97.0,RSD=1.3；绿原酸流动相为甲醇：水：冰醋酸(25:74:1,V/V/V)，检测波长：320nm，平均回收率为96.1,RSD=2.1；黄芩苷流动相为乙腈：水：四氢呋喃(20.5:77.5:2,V/V/V，磷酸调至pH

9、4)，检测波长：274nm，平均回收率为99.5，RSD=1.4。本法操作简便，结果准确。别名：氯原酸,咖啡鞣酸绿原酸英文名： Chlorogenic acid化学名：3 咖啡酰奎尼酸 Cyclohexanecarboxylic acid, 3-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-1-oxy-2-propenyloxy-1,4,5-trihydroxy-1, 1S-(1 , 3 , 4 , 5 )系统名：1，3，4，5-四羟基环己烷羧酸-（3，4-二羟基肉桂酸酯）产品名称：绿原酸; (1S,3R,4R,5R)-3-3-(3,4-二羟基苯基)-1-氧代-2-丙烯基氧-1,4,5-三羟

10、基环己烷甲酸分子式及分子量：C16H18O9=354.30绿原酸植物来源:主要存在于金银花、杜仲叶中.其产品分别为金银花提取物杜仲提取物绿原酸物理性状：半水合物为针状结晶（水）。110 变为无水化合物，熔点 208 ， 24D-35.2 （ c=2.8）。25 水中溶解度为 4%，热水中溶解度更大；易溶于乙醇及丙酮，极微溶于醋酸乙酯。 13CNMR（H2O）A：126.6(C-1), 114.1(C-2), 144.2(C-3), 147.0(C-4), 116.0(C-5), 122.6(C-6), 145.9(C-7), 115.2(C-8), 168.9(C-9); B: 76.6(C-

11、1), 38.3(C-2), 70.6(C-3), 72.8(C-4), 71.0(C-5), 37.3(C-6), 180.1(C-7)1 。 编辑本段绿原酸作用与用途：具有较广泛的抗菌作用，但在体内能被蛋白质灭活 11 。与咖啡酸相似，口服或腹腔注射时，可提高大鼠的中枢兴奋性。可增加大鼠及小鼠的小肠蠕动和大鼠子宫的张力。有利胆作用，能增进大鼠的胆汁分泌 12-14 。对人有致敏作用，吸入含有本品的植物尘埃后，可发生气喘、皮炎等，但食入后可经小肠分泌物作用，变为无致敏性物质 15,16 。有止血、增高白血球 17 。及抗病毒作用 18 。具有缩短血凝及出血时间的作用 19 。 毒性很小，幼大

12、鼠口服的 LD50 大于 1g/kg ，腹腔注射大于 0.25g/kg20 。(1) 降压作用：经多年临床试验证实的，杜仲绿原酸有明显的降压作用，而且疗效平稳，无毒、无副作用。美国威斯康星大学（Charles J Sih, et al . Separation and synthesis of pinoresinol diglucoside moides olive J Am Chem Soc 1976,98(17):5412等研究发现杜仲绿降血压的有效成分是松酯醇二葡萄糖苷，桃叶珊瑚甙，绿原酸，和杜仲绿原酸多糖类。(2) 抗肿瘤作用：现代药理实验证明杜仲绿原酸有抗癌和抑癌之功效，日本学者研究

13、了杜仲绿原酸的变异原性抑制作用(antimutagenicity)，发现该作用与绿原酸等抗变异原性成分有关，揭示了绿原酸对肿瘤预防的重要意义。(3) 补肾、增强机体免疫作用：实验表明明杜仲绿原酸具有兴奋垂体肾上腺皮质系统、增强肾上腺皮质功能的作用，说明杜仲绿原酸作为助阳补肾是有科学依据的。研究发现杜仲绿原酸既能启动单核巨噬细胞系统和腹腔巨噬细胞系统的吞噬活性，增强机体的非特异免疫功能，又能对迟发型超敏反应起抑制作用。(4) 抗氧化、抗衰老、抗肌肉骨骼老化：杜仲绿原酸含有一种可促进人体的皮肤、骨骼、肌肉中胶蛋白的合成与分解的特殊成分，具有促进代谢、防止衰退的功能，可用来预防宇航员因太空失重而引起

14、的骨骼和肌肉衰退，同时发现杜仲绿原酸无论在体内还是体外，均有明显抗自由基作用。(5) 抗菌、抗病毒：杜仲绿原酸有较强的抗菌消炎作用，桃叶珊瑚苷及其多聚体有明显的抑菌作用，桃叶珊瑚苷元对革兰氏阴性、阳性菌都有抑制作用。桃叶珊瑚苷有抑菌、利尿作用，并能促进伤口愈合；桃叶珊瑚苷与葡萄糖苷一起预培养后还会产生明显的抗病毒作用，但其本身开不具有抗病毒功能。日本爱知医科大学加龄医科学研究所经研究确认，从杜仲中提取的碱性物质有抗破坏人体免疫系统病毒的功能，这种物质有可能用于预防和治疗艾滋病。(6) 其它作用：利尿，利胆，降血脂，保胎 绿原酸的生物活性绿原酸被认为是众多药材和中成药抗菌解毒、消炎利胆的主要有效

15、成分，通常被作为定性甚至定量的指标。 据报道，绿原酸的主要生物活性有（1）对透明质酸酶及葡萄糖-6-磷酸酶的抑制作用；（2）对自由基的清除及抗脂质过氧化作用；（3）抗诱变作用；（4）保肝利胆作用；（5）抗菌、抗病毒及解痉等作用。检测方法南京泽朗杨东骋敬告：绿原酸易分解照高效液相色谱法（附录 D）测定。 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.4%磷酸 溶液（13：87）为流动相；检测波长为327nm。理论板数按绿原酸峰计算不低于1000。 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品适量，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成 每1ml含4g的溶液，即得（10以下保存）。 酯化反

16、应醇跟羧酸或含氧无机酸生成酯和水，这种反应叫酯化反应。50-150分钟绿原酸是一种重要的生物活性物质和化学试剂。在我国 1 70种有抗菌消炎作用的中成药中均含有绿原酸的成分。它具有具有利胆、抗菌、抗病毒、降压、增高白血球及兴奋中枢神经系统等多种药理作用 1 ,是保健品、食品、药品、化妆品等工业的重要原料。目前我国提取绿原酸多以金银花为原料 ,其绿原酸提取成本高 ,导致目前应用的绿原酸多从国外进口。研究表明 ,杜仲叶中含有 1 % 5 .5 %绿原酸 ,且杜仲叶价格仅占金银花的 1 /2 0 1 /40。近年来 ,我国杜仲叶利用量增长较快 ,年采收数量达 40 0万吨以上 ,但利用率仅占采收叶的

17、 1 0 % 2 0 % 本研究利用昆明种小白鼠，对向日葵叶中提取的绿原酸进行了降血糖的药效学试验研究。试验包括对向日葵叶中绿原酸采用不同方法进行提取、分离、鉴定和含量测定试验：四氧嘧啶型糖尿病小鼠模型建立试验；绿原酸粗提物对四氧嘧啶型糖尿病小鼠血糖的影响及剂量依赖性试验；绿原酸粗提物对四氧嘧啶型糖尿病小鼠肾重体重的影响试验；绿原酸粗提物对正常小鼠血糖的影响试验；绿原酸粗提物对四氧嘧啶型糖尿病小鼠的SOD、MDA、NO、NOS、TG的影响试验；绿原酸粗提物对四氧嘧啶型糖尿病小鼠代谢影响试验。 通过对向日葵叶中绿原酸采用不同方法进行提取、分离、鉴定和含量测定，试验结果表明，提取绿原酸的最佳工艺条

18、件是10倍量70乙醇为浸提剂，在80，pH6的条件下浸泡，回流3。0h得出绿原酸含量最高为1。51。 绿原酸粗提物对四氧嘧啶型糖尿病小鼠血糖的影响及剂量依赖性试验结果表明，三种剂量的药物均可有效降低四氧嘧啶型糖尿病小鼠血糖；给药后高、中、低剂量组间血糖值无显著性差异(P0。05)，说明该药物无剂量依赖性。 对于绿原酸粗提物对四氧嘧啶型糖尿病小鼠肾重体重的影响试验结果表明，。杜仲叶中绿原酸的提取纯化研究2008-09-27 07:23           作者：袁华，邓良，杨小俊，闫志国 ，吴元欣

19、. 绿原酸；,提取；,纯化；,杜仲叶摘要：目的研究杜仲叶中绿原酸的提取纯化方法。方法采用水提、絮凝脱色、树脂吸附、重结晶工艺提取纯化。结果杜仲叶的水浸提液浓缩后用1%壳聚糖絮凝去杂、活性碳脱色得到进样液，进样液用NKA-9树脂吸附，50%乙醇解吸，洗脱液浓缩后的粗品经甲醇重结晶得到纯度97%的绿原酸，提取率65%。结论 优化完善了杜仲叶中绿原酸的提取纯化方法，为杜仲资源的充分综合利用和产业化开发提供了参考。关键词：绿原酸； 提取； 纯化； 杜仲叶Study on the Extraction and Purification of Chlorogenic Acid in Eucommia ul

20、moides Oliv. LeavesAbstract：Objective To study the optimum extraction and purification process for chlorogenic acid in Eucommia ulmoides Oliv. Leaves. MethodsThe process was carried out by water extraction, 1% chitosan flocculation, actived char decolorization, NKA9 resin adsorption, 50% ethanol des

21、orption and methanol recrystallization. ResultsThe extracting ratio of chlorogenic acid was 68% with purity of 97%.ConclusionAn optimum and improved technology for the extraction and purification of chlorogenic acid in Eucommia ulmoides Oliv. Leaves was investigated. It is helpful to industrial prod

22、uction of chlorogenic acid.Key words：Chlorogenic acid; Extraction; Purification; Eucommia ulmoides Oliv.    杜仲Eucommia ulmoides Oliv.是我国特有的经济树种，其药用价值历来受到人们关注。杜仲中主要有效成分绿原酸具有抗菌、抗病毒、利胆、保肝、降压、清除自由基等作用。2000多年前我国的神农本草经就将之列为中药上品。近年来研究表明杜仲叶中的主要化学成分和杜仲皮基本一致，且杜仲叶中绿原酸含量更为丰富，达到干叶重的1%5%，因此从原材料丰富且价

23、廉的杜仲叶中提取绿原酸成为研究热点13。其中钱骅4、刘军海等5提出的大孔吸附树脂提取纯化法展示了一定的工业化前景，但报道的树脂分离效果不一致，且均未见有关终产品纯度及收率的报道。杜仲叶提取物中除含绿原酸外，还含有鞣质、蛋白质、多糖等物质。为了得到纯度较高的绿原酸，必须对提取液进行多步分离纯化。本文在文献工作的基础上，围绕产业化目标，改进完善了提取制备工艺，采用水提、絮凝脱色、树脂吸附、重结晶工艺提取制备了纯度与收率较高的绿原酸。1 材料与方法1.1   材料与仪器杜仲叶采自湖北五峰（风干、粉碎）；主要试剂乙醇、甲醇、稀盐酸等均为分析纯；壳聚糖为生化试剂；NKA9，AB8，N

24、KA型树脂(南开大学化工厂)；绿原酸（中国药品生物制品检定所）。ZF型紫外分析仪（上海顾村电光仪器厂）；Agilent 1100型高效液相色谱仪。1.2   提取纯化工艺准确称取10.0 g杜仲叶，用去离子水2×120 ml在80下动态提取150 min，过滤,提取液减压浓缩至100 ml，浓缩液中加入1%壳聚糖溶液4 ml絮凝，过滤，滤液用活性碳脱色，得进样清液，用NKA9树脂吸附进样清液，用50%乙醇溶液洗脱，洗脱液减压浓缩，得绿原酸粗品，经甲醇重结晶得绿原酸纯品。提取率65%（以杜仲叶中绿原酸含量计），纯度97%。1.3   绿原酸的含量

25、检测绿原酸的含量测定参照文献6，7进行。2   结果2.1 提取条件2.1.1 提取溶剂的选择杜仲叶中绿原酸的提取一般选用40%乙醇水溶液，使用乙醇水溶液提取除增加溶剂成本以外，提取液中的脂溶性成分增加，造成后续处理困难，绿原酸在热水中溶解度较大，本文选用水为提取溶剂。2.1.2 提取温度的选择随着提取温度的升高，绿原酸得率不断增加，当温度高于80时，绿原酸得率开始下降。随着温度的升高，杜仲叶中其它成分的溶出也不断增加，同时考虑到绿原酸的热不稳定性，提取温度控制在80以下。2.1.3 提取时间的影响随着时间的延长，绿原酸得率逐渐升高，尤其是在50150 min内，二者几乎呈

26、现良好的线性关系，随后逐渐达到提取平衡状态。2.1.4 浸提液pH值的影响在温度、料液比、提取时间一致的条件下，用稀盐酸调节提取溶剂的pH值，当pH值为4时，绿原酸得率较高。因此，绿原酸的最佳提取工艺条件为：每10.0 g杜仲叶，用2×120 ml去离子水在pH=4及温度80下动态提取150 min。2.2 絮凝脱色传统中药提取工艺中常常采用水提醇沉法，目的是除去提取液中的淀粉、树胶、蛋白质、粘液质、果胶、多糖、无机盐等无效成分。实验发现，水提醇沉法中醇的浓度越高越有利于除去杂质，但有效成分由于醇沉包夹损失也随之增大。另外水提醇沉工艺还存在乙醇消耗量大、生产成本高、生产安全系数低等缺

27、点，因此需要改进工艺。絮凝澄清法是在中药提取液或提取浓缩液中加入一种絮凝剂以吸附架桥及电中和方式除去溶液中的某些物质，以达到分离纯化的目的8。实验通过絮凝剂种类、浓度及絮凝温度、酸度的选择比较，确定优化的絮凝脱色工艺为：每100 ml浓缩液中加入1%壳聚糖溶液4 ml，搅拌，在60静置60 min，过滤，滤液用1g活性碳脱色，得进样清液。2.3 大孔吸附树脂的选择结合杜仲叶浸提物的特性，本文对NKA-9，AB-8，NKA-3种极性的大孔吸附树脂进行选择比较。树脂根据文献4，5经预处理、再生后，进行静态吸附与解吸实验，3种不同型号的大孔吸附树脂对绿原酸溶液（4.8 mgml-1，10 ml）得到

28、的吸附量、吸附率和解吸率如表1所示。表1 3种树脂对绿原酸的吸附和解吸情况（略）由表1知，3种大孔吸附树脂对绿原酸均具有较高的吸附量和吸附率，但是AB-8型树脂吸附的绿原酸很难被解吸下来，不宜用作分离绿原酸的树脂，只有NKA-9，NKA-型树脂较为适合。比较可知，NKA-9型树脂在静态吸附时具有较高的吸附量和吸附率，而且易解吸，对绿原酸具有较好的富集效果。2.4 NKA-9树脂对绿原酸的吸附实验2.4.1   动态吸附曲线将浓度为3.0 mgml-1的绿原酸溶液加入装有200gNKA-9型大孔树脂的玻璃层析柱中，在流速为2.0 mlmin-1时（可用BV/h表示，即每小时流

29、过床层的流动相的体积为树脂床体积Bed Volume的倍数), 测定流出液中绿原酸的浓度，绘制吸附曲线（见图1）。结果表明，该树脂可处理78倍树脂床体积的进样液。图1 NKA-9树脂对绿原酸的吸附曲线（略）2.4.2 进样液流速对吸附的影响为了进行有效的吸附，在树脂吸附过程中有必要使固液两相有充分的接触时间。进样流速过大，树脂对绿原酸来不及吸附，导致吸附率下降；进样流速过小，虽然吸附较充分，但是吸附时间长，效率较低。将浓度为3.0 mgml-1的绿原酸溶液过柱，考察单位时间内树脂的吸附量与不同进样流速的关系，结果表明，在流速为2.0 mlmin-1时，吸附效果最好。见图2。图2 进样液流速对吸

30、附的影响 （略）2.4.3 进样液pH值对吸附的影响在不同pH值下进行吸附实验, 结果表明，绿原酸作为多羟基酚酸，在酸性条件下易被吸附。因为在酸性条件下，绿原酸以分子形式存在，树脂对其吸附作用增强；在强酸条件下，以内酯形式存在的绿原酸容易水解；在碱性条件下，以离子形式存在的绿原酸则不易被吸附。由图3可知，pH值为3时，吸附效果最好。2.5   NKA-9树脂对绿原酸的脱附实验2.5.1 洗脱液的选择化合物经树脂吸附后，根据吸附力的强弱不同而选用不同的洗脱剂。一般来说，吸附剂与吸附质以分子间色散力作用时，吸附力较弱，易于洗脱；而当吸附剂与吸附质以偶极间作用力或氢键作用时，吸附

31、力强，不易于洗脱。NKA-9大孔树脂极性较强，同时绿原酸是含有酚羟基化合物，容易与树脂形成氢键，对绿原酸洗脱需要用对它有更强的溶解能力的溶剂。本实验中选用不同浓度的乙醇水溶液作为洗脱剂，结果见图4所示。图3 进样液pH值对吸附的影响（略）图4 洗脱剂乙醇浓度与解吸率的关系（略）实验中分别用不同浓度的乙醇溶液进行洗脱，测定洗脱液中绿原酸的含量并计算解吸率。其中50%和70%的乙醇溶液可将树脂吸附的绿原酸基本洗脱下来。对洗脱液进行薄层分析发现，70%的乙醇溶液解吸率虽然较高，但是洗脱液中杂质含量也较高，达不到有效成分分离的效果，所以实验中选择50%的乙醇溶液作为洗脱液。2.5.2 

32、60; 洗脱曲线的绘制进样清液吸附后，采用50%乙醇溶液洗脱，洗脱流速控制为1.0BV/h，收集洗脱液并测定洗脱液中绿原酸含量，绘制其洗脱曲线如图5所示。图5 NKA-9树脂的洗脱曲线（略）可见，用3倍树脂床体积的洗脱剂基本上可将绿原酸洗脱下来，而且洗脱峰较集中。将50%的乙醇洗脱液减压浓缩，低温干燥后得到绿原酸的粗产品。2.6. 重结晶绿原酸粗品用甲醇重结晶，真空干燥，得白色针状晶体。产物结构经IR，HNMR分析确证，HPLC测定含量97.91%。3 结论本研究优化了从杜仲叶中提取绿原酸的工艺条件：杜仲叶用去离子水在80浸提150 min，提取液经浓缩、絮凝除杂、吸附脱色得到进样清液，进样液

33、经NKA-9大孔树脂处理得到绿原酸粗品，后者经重结晶得到含量97%的绿原酸，提取率65%。我国杜仲资源丰富，从杜仲叶中提取绿原酸的工艺条件优化研究为杜仲资源的充分综合利用和产业化开发提供了基础数据。参考文献：1 马柏林，梁淑芳.杜仲叶中绿原酸的提取分离研究进展J.陕西林业科技，2003，4：74.2 蔚 芹，景谦平，马希汉.杜仲叶中绿原酸的提取工艺条件研究J.林产化学与工业，2001，21（4）：27.3 陈晓娟，周春山，魏 巍.杜仲叶中绿原酸和黄酮不同提取方法的比较J.中国生化药物杂志，2006，27（1）：38.4 钱 骅，赵伯涛，张卫明.杜仲叶绿原酸的提取分离J.中国野生植物资源，200

34、1，20（4）：15.5 刘军海，裘爱泳.杜仲叶绿原酸提取纯化工艺的研究J.中药材，2004，27（12）：943.6 钟方晓.高效液相及紫外分光光度法测定金银花中绿原酸和异绿原酸含量方法学比较J.时珍国医国药，2005，16（3）：212.7 刘圣金，狄留庆，吴德康，等.高效液相色谱法测定杜仲中绿原酸的含量J.中国中医药信息杂志，2006，13（1）：44.8 王龙虎，吴国良，程冀宇.壳聚糖及其衍生物在中药制药工业中的应用J.中国中药摘要：绿原酸是一种重要的生物活性物质，是许多植物、果汁和中药材的主要有效成分之一。该文对绿原酸的分布、性质、结构、生物活性、提取纯化工艺和应用前景进行综述。 关

35、键词：绿原酸；生物活性；提取；纯化 绿原酸是一种缩酚酸，属酚类化合物，是植物在有氧呼吸过程中，经草莽酸途径形成的一种苯丙素类化合物。绿原酸是一种重要的生理活性物质，具有抗菌、抗病毒、升高百细胞、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基等作用。其广泛存在于许多植物中，如葵花籽、水果、蔬菜、大豆、小麦、可可豆、咖啡豆和一些中草药中，尤其葵花籽、可可豆、咖啡豆、沙棘果及传统中草药，如金银花、杜仲中其含量较高。它是许多药材和中成药的主要有效成分之一；同时，绿原酸含量多少又是某些成药的质量指标，也是许多果汁饮料营养成分之一。绿原酸不仅在医药工业，而且在食品、日用化工中也有广泛应用。本文对绿

36、原酸的分布、理化性质和结构、生物活性及提取、纯化和应用作一简单介绍综述，旨在开发和利用绿原酸资源。1 绿原酸分布及存在 绿原酸广泛存在植物中，如葵花籽、水果、蔬菜（土豆）、咖啡豆、可可豆、小麦等。因此人们在日常生活中，都能从食用的粮食、蔬菜、水果、茶和果汁中或多或少地摄取绿原酸类物质。绿原酸只要存在于忍冬科忍冬属、菊科嵩属植物中，但含量较高的植物不多，其中包括杜仲、金银花、向日葵、继花、咖啡、可可树。绿原酸是金银花、杜仲的主要有效成分之一。金银花中绿原酸含量最高的当属大花毛忍冬花，最高可达11.14 %，其次是红腺忍冬花最高达7.01%，含量较稳定者当属贵州忍冬花，其含量约5.3-5.7%。其

37、中金银花越冬老叶中绿原酸是普通叶1.41倍，忍冬藤9.08倍。不同时期杜仲叶中绿原酸含量差异显著，在年周期中，杜仲叶绿原酸含量以6月份叶含量最高，其次是1月份，饵月份叶最低。据报道，幼苗杜仲叶中绿原酸含量有的高达10%左右，不同地区杜仲中绿原酸含量差异显著，遵义地区杜仲绿原酸含量最高，宜昌地区的含量偏低。葵花籽也是绿原酸主要来源，葵花籽壳和仁中都存在。在葵花籽仁中，绿原酸主要分布在葵花籽仁的糊粉层或细胞蛋白质颗粒中。据测定，葵花籽中绿原酸含量为1.5%-3.3%，葵花籽仁中含绿原酸2.1%-3.5%。我国是葵花籽生产大国，利用葵花籽壳和葵花籽仁先提取绿原酸，然后在进一步提取葵花籽蛋白质，可增加

38、葵花籽粕的利用价值，因此，它是一条有效的综合利用途径。2 绿原酸理化性质和结构绿原酸类化合物是含有羟基和邻二酚羟基的有机物，除极易溶于乙醇外，还易溶于水、甲醇和丙酮等溶剂，微溶于乙酸乙酯等极性溶剂中，难溶于氯仿、乙醚等弱极性溶剂。因此，利用这一性质可将绿原酸从植物中提取出来。绿原酸分子式为：C16H18O9，分子量为354.3，它的半水化合物为白色或微黄色针状结晶，110变为无水化合物，熔点208，D24-35.2(C=2.8)，在25水中溶解度为4%，热水中溶解度更大，且溶解度随温度而变化。绿原酸由奎尼酸和咖啡酸缩合而成，为极性有机酸，不太稳定。在从植物提取过程中，通过水解和相继分子中都含有

39、邻二酚羟基，受热、见光易氧化，因此供试液要在50以下浓缩，并在阴凉，避光下保存备用。绿原酸的邻二酚羟基结构不稳定，高温加热易氧化分解，因此，高温及长时间加热不利于绿原酸提取。在碱性条件下，绿原酸可发生水解，在碱性及高温时会氧化成为绿色醌类。植物体内存在绿原酸往往是混合物而非单一组分，从葵花籽仁和金银花中提取绿原酸含有不同数量异构体。3 绿原酸生物活性绿原酸具有广泛的生物活性。研究表明绿原酸对急性咽喉炎症和化脓性皮肤疾病疗效显著，具有利胆、抗菌、抗病毒、止血、增加白血球、缩短血凝和出血时间以及兴奋中枢神经系统等多种要用功能。现代科学对绿原酸生物活性的研究已深入到食品、医药、保健和日用化工等领域。

40、3.1 清除体内自由基和抗氧化作用绿原酸及其衍生物比抗坏血酸，dl-生育酚和咖啡酸具有更强的自由基清除效果，可有效清除DPPH自由基(1,1-diphenyl-2-picrylhydazyl)、羟基自由基和超氧阴离子自由基；它还可以抑制低密度脂蛋白氧化，对维持机体细胞正常的结构和功能，防止和延缓肿瘤、突变和衰变等现象的发生具有重要的作用。国内外研究表明，绿原酸是一种有效的酸性抗氧化剂，其抗氧化能力强于咖啡酸、对羟苯酸、阿魏酸和丁香酸，以及常见的抗氧化剂，如丁基羟基香醚(BHA)和生育酚，而与丁基羟基甲苯(BHT)抗氧化能力相当。3.2 抑制突变和抗肿瘤绿原酸具有较强的抑制突变能力，它可抑制黄曲

41、霉霉素B1引发的突变和亚硝化反应引发的突变并能有效降低-射线引起的骨髓红细胞突变；同时，绿原酸还可通过降低致癌物利用率及其肝脏中运输以达到防癌、抗癌效果，并能抑制由苯并芘，4-NQO(氧化硝基喹啉)引发的癌症；绿原酸对大肠癌、肝癌和喉癌具有显著的抑制作用，它被认为是癌症的有效防护剂。3.3 对心血管作用异绿原酸B对大鼠具有较强促进前列腺还素(PGI2)的释放和抗血小板聚集作用；对豚鼠肺碎片感应的抗体诱导SRS-A释放抑制率达62.3%。此外，对血小板血栓素生物合成和氢过氧化物诱导的内皮素细胞损伤有极强抑制作用。3.4 其它生物活性绿原酸及其衍生物在抗艾滋病毒(HTV)研究中表现出一定抑制效果，

42、绿原酸对质酸梅(HAase)及葡萄糖-6-磷酸酶有特殊抑制作用，对创伤治愈、皮肤滋润、关节润滑和炎症防止等均有一定的功效。研究还表明，口服绿原酸能显著刺激胆汁的分泌，具有利胆功效；绿原酸对胃溃疡也有选住抑制作用效果，它还可有效抑制H2O2引起大鼠红细胞溶血作用。4 绿原酸提取和纯化方法 4.1 水提醇沉法利用绿原酸易溶于水的特性，采用水作溶剂，加热煮沸提取，然后用高浓度醇沉淀蛋白质，多糖等杂质。该方法工艺简单、经济，但是水提取液中杂质较多，醇沉过程中伴随吸附夹带，使部分绿原酸消失。4.2 水提石灰乳沉淀法绿原酸与钙盐生成沉淀，在水提取液中加入石灰乳，是绿原酸沉淀下来，然后用硫酸分解沉淀。该方法

43、操作简单、经济，其缺点是石灰乳沉淀不完全，硫酸钙对绿原酸有吸附作用，从而降低产率。4.3 醇提铅盐沉淀法采用乙醇溶剂，在醇提液中加入乙酸铅溶液，使绿原酸以铅盐的形式沉淀下来。优点是可得到较纯绿原酸，缺点是工艺复杂，产量低，并使用有毒金属铅，可能对绿原酸产品造成一定的污染。4.4 超声波法利用超声波能击碎细胞壁，使细胞内组分渗透到溶液中，从而叨叨分离的目的。该方法综合成本低，污染小，无水提法难以过滤的制约因素，无醇提法中因溶剂使用带来不利之处，而且绿原酸得率高，但目前仅限于实验室规模。4.5 聚酰胺柱层析法依据聚酰胺对氢键的特殊吸附性来达到物质分离。特别适合分离酚类、醌类、黄铜等化合物，对鞣质的

44、吸附特强，近乎不可逆。该法能使绿原酸和黄铜获得较好的分离和提取，吸附剂聚酰胺可反复使用，反复层析可以纯化，纯化度高；但操作麻烦，产量低，洗脱耗费时间长，主要用于分析研究中。4.6 超滤法依照超滤膜物理化学性能，采用超滤可除去水提或醇提液中多糖、蛋白质等大分子，而绿原酸等小分子则可透过膜的一种提取方法。优点是能有效保留有效成分，无污染，绿原酸得率较高；但该法对提取液预处理要求高，产量易受超滤条件的影响，而且膜清洗麻烦。4.7 酶法采用纤维素酶和果胶酶分别或联合处理药材(金银花)，然后在醇提。金银花用纤维素酶处理后，结构致密细胞壁中纤维素水解成水溶性糖类物质，而细胞壁水解有利于胞内物质(绿原酸)溶

45、出。该方法绿原酸得率比乙醇回流法提高约25.97%，反应条件温和；但采用酶法处理，大大增加生产成本，其经济可行性优待于进一步研究。4.8 超临界法以超临界CO2为溶剂从药材中提取绿原酸。该方法操作范围广，可有针对性提取有效成分，同时萃取同蒸馏合为一体，不需要溶剂，无污染，产品纯度高。但设备昂贵，产业化生产有一定困难。4.9 大孔树脂吸附法大孔树脂吸附特别适合水溶性化合物纯化分离。该法具有吸附容量大，选择性好，易于解吸，机械强度高，再生处理简单，吸附速度快，操作简单，得率恒定，产品质量稳定，生产成本低等特点，且吸附法仅用少量溶媒洗脱树脂就能达到浓缩目的，但耗用时间长，吸附树脂清洗困难。5 绿原酸

46、的应用 5.1 食品工业绿原酸具有利胆、抗菌、抗病毒、止血、增加白血球、缩短血凝和出血时间及兴奋中枢神经系统生理功能，可用绿原酸制作保健食品或饮料。绿原酸具有增香和护色作用，可用于食品和果品保鲜。绿原酸用语果汁保险，可有效防止饮料和食品的腐败变质；Wilska等人研究还发现，绿原酸大大提高草莓等果汁稳定性。天然食品抗氧化剂越来越受消费者欢迎，绿原酸是一种新型高效的酚型天然抗氧化剂。在某些食品中可取代或部分取代目前常用的人工合成抗氧化剂。在猪油中，若添加少量绿原酸，可提高猪油氧化稳定性，增长贮存期。将少量绿原酸加到天然色素溶液中，对色素颜色有稳定作用，因此，绿原酸又是一种良好的食品添加剂。目前，

47、日本将葵花籽粕中提取的绿原酸成功开发成水溶性天然抗氧化剂。5.2 医药工业卫生部药品标准收录具有清热解毒，抗菌消炎的中成药170种，均含有绿原酸且为主要成分。现在，在银黄制剂、双黄连制剂等药品的生产中，已将绿原酸作为质量控制的重要指标之一，从植物中提取纯的绿原酸，可作为二类新药。绿原酸还是很重要化学试剂，在生理生化分析和化学工业中具有广泛应用，开发医用甚至化学纯绿原酸具有巨大的社会和经济效益。5.3 日用化妆业Facino等人研究，以绿原酸为代表的天然多酚物质，发现它们可以保护胶原蛋白不受活性氧等自由基伤害，并能有效防止紫外线对人体皮肤产生伤害作用。现已有多项添加绿原酸后用于抗脲酶化妆品、皮肤

48、防晒和防止自外乡和染发剂对头发损伤洗发水的欧洲专利。日本同样利用绿原酸及其衍生物抗氧化特性已研制出抗衰老护肤品。6 结束语绿原酸是一种重要的生理活性物质。国外(美、日、德等)以往是从咖啡豆中提取，现已开始转向从杜仲叶中提取；我国一直从金银花中提取，多数产品是浸膏，其含量15%-30%。绿原酸作为一种重要的化学试剂，我国目前尚没有生产医用或化学纯的厂家，绿原酸纯品，我国只能依靠进口，价格十分昂贵，因此，开发和利用绿原酸资源具有巨大的社会效益和经济效益。 我国向日葵生产种植已成为仅次于油菜籽、大豆、棉籽和花生的第五大油料作物，年总产量位居世界第六位，但对向日葵籽粕利用尚十分薄弱，这为我们开发绿原酸

49、提供充分的原料资源。银花中绿原酸的提取纯化方法本发明公开了一种中草药功能性成分的提取纯化方法，目的是要提供一种从金银花中提取纯化绿原酸的方法，解决提取物得率和纯度低的问题。所采取的技术方案是：采用稀乙醇对金银花进行二次回流提取，浓缩提取物再用絮凝法初步除杂纯化，最后采用大孔树脂法或酸性乙酸乙酯萃取法纯化精制。本发明将金银花粗碎成小段，在最佳状态下提取，经初步除杂及再纯化，方法简单、易行，绿原酸的损失少，产品收得率和纯度都很高。大孔树脂吸附提取高含量绿原酸的工艺方法目前从金银花中提取绿原酸的工艺落后，提取物中绿原酸含量低提取成本高。本发明由金银花粉碎、绿原酸水提取液提取及大孔树脂吸附高含量绿原酸

50、的分离工艺组成，其特征是后者通过绿原酸提液加入大孔树脂柱中进行饱和吸附，低浓度乙醇洗涤溶解树脂柱中的绿原酸，使其与柱分离成为绿原酸洗脱液，再回收其中乙醇，将余下的无乙醇绿原酸洗脱液浓缩，然后喷雾干燥可得高于40绿原酸含量的成品干粉；用高浓度甲醇洗涤溶解树脂柱中的异绿原酸，使其与柱分离成为异绿酸洗脱液，回收其中甲醇后将洗脱液浓缩、喷雾干燥可得异绿原酸成品干粉。本法具有工艺简单、成本低、易操作、制取成品绿原酸含量高、具有显著经济效益等突出优点。一种制备绿原酸的方法一种制备绿原酸的方法，属于一种植物药用成分的提取方法。本发明的方法包括用溶液对原料回流提取，抽滤，合并滤液，滤液减压浓缩及粗提物分离纯化

51、，所用原料为干牛蒡叶。用pH23的有机溶剂分次回流提取干牛蒡叶3hr；每次提取后抽滤，合并滤液，滤液减压浓缩，回收乙醇，得牛蒡叶粗提物；然后，将牛蒡叶粗提物过聚酰胺柱，用水及甲醇洗脱，洗脱液经浓缩、精制，得绿原酸纯品。本发明为绿原酸生产寻找到了一种牛蒡叶新药源，降低了绿原酸的生产成本，且操作简单。绿原酸、异绿原酸的组合物及它的医学用途本发明公开了从天然植物中提取获得的绿原酸、异绿原酸，经药理试验证明其具有明显的抗SARS病毒活性，将具有该活性的绿原酸、异绿原酸与维生素C为主要活性成份，根据不同要求加入赋形剂、辅剂或载体，配制成不同剂型的组合物。它们可在制备治疗、预防SARS病毒引起疾病的药物中

52、应用。绿原酸保健食品本发明涉及一种绿原酸（h?）保健食品或饮料。可在食品或饮料中加入绿原酸而制成，也可采用中药金银花等中药材提取而制得产品原液，经精制而获得液体产品或膏状或不定型颗粒状产品。本发明的保健食品，香甜可口味道好，具备清热解毒、养颜润肤、解除烟酒过多等特点。从金银花中提取绿原酸的工艺本发明公开了一种从金银花中提取绿原酸的工艺，其特征是金银花加酸性乙醇浸泡一定时间，加热回流提取一定时间，药渣再加酸性乙醇回流提取一定时间，合并药液，减压回收乙醇，浓缩、精制。本发明方法简单，成本低，收得率高，具有社会效益和经济效益。杜仲叶制备绿原酸工艺本发明提供一种用杜仲叶制备绿原酸的工艺，其主要由超声预

53、处理和高温提取、超滤、乙酸乙酯萃取、树脂分离等步骤来完成。本发明由于采用超声波预处理，利用超滤技术去除大分子，用树脂吸附绿源酸或调节p值，使绿源酸在水层与有机层分离，大大提高了绿原酸的获得率及其纯度，且成本低，无有害溶剂，工艺简易，适用工业化生产。绿原酸在制备具有预防和治疗鼻咽癌功效的药物中的应用绿原酸在制备具有预防和治疗鼻咽癌功效的药物中的应用，以绿原酸为基本有效药物成分，与药学中可以接受的辅助性成分共同组成用于预防和治疗鼻咽癌功效的药物。药理实验证明，绿原酸具有显著的预防和治疗鼻咽癌的功效，并具有低毒、安全的特点。绿原酸在制备具有治疗女性器官肿瘤功效的药物中的应用绿原酸在制备具有治疗女性器

54、官肿瘤功效的药物中的应用，以绿原酸为基本有效药物成分，与药学中可以接受的辅助性成分共同组成用于治疗包括女性乳腺癌，卵巢癌和子宫体癌在内的多种女性器官肿瘤功效的药物。药理实验证明，绿原酸具有显著的治疗这些女性器官肿瘤的功效，并具有低毒、安全的特点。绿原酸在制备具有增加骨髓细胞功效的药物中的用途本发明提供了绿原酸Chlorogenic acid在制备增加骨髓细胞功效的药物中的用途。本发明还提供了含有绿原酸为活性成分的药物组合物。绿原酸可治疗各种原因引起的贫血，且不仅仅限于失血性贫血、溶血性贫血，造血不良性贫血包括巨细胞性贫血、再生障碍性贫血和脾功能亢进，对各种原因引起的白细胞减少状态、粒细胞减少症

55、、粒细胞缺乏症有治疗作用，对各种原因引起的巨核系统改变如特发性血小板减少性紫癜等有治疗作用；对各种原因引起的骨髓纤维化，骨髓感染有一定治疗作用。绿原酸在制备抗缺氧的药物或食品中的用途本发明提供了绿原酸在制备抗缺氧的药物或食品中的用途。本发明还提供了含有绿原酸为活性成分用于抗缺氧的药物组合物。通过试验，发现绿原酸具有抗缺氧的作用和功效。绿原酸可以预防贫氧性缺氧，缓解由生物氧化障碍所致的中毒性缺氧，对血液性缺氧和循环性缺氧也有一定的功效。且绿原酸长期给药具有毒性低的优点，适用于预防及治疗用药。一种提取绿原酸的方法本发明公开了一种提取绿原酸的方法。该方法包括下述步骤：1)将朝鲜蓟叶片与乙醇溶液混和，

56、在液相中乙醇的体积百分比浓度为60-80的条件下提取，收集液相得到提取液；2)在提取液中加入澄清剂，沉淀溶液中的蛋白、鞣质、树胶杂质，过滤得到滤液；3)将滤液过以大孔树脂为填料的层析柱，先用水淋洗至洗脱液无色，然后以pH值为1-3的乙醇溶液为洗脱剂洗脱，回收含有绿原酸的洗脱液；4)浓缩含有绿原酸的洗脱液得到含有绿原酸的固体，然后用体积百分浓度为95以上的乙醇溶液、水依次重悬洗涤3-5次。本发明的方法得到绿原酸的纯度达到90以上，生产成本低，得到的产品安全性好。高纯度绿原酸制剂本发明涉及高纯度绿原酸为原料制备成药学上可应用于临床的各种剂型的药品。采用含量95-105的绿原酸制成含1mg-3g的各

57、种注射液、无菌粉针、各种片剂、胶囊、口服液、滴眼液、软膏、各种缓控释制剂。绿原酸作为一种有效的中药成分，是大约170余种中成药的定性或者定量指标，但在这些中成药中，绿原酸都是以混合组分入药，而不是提取成高纯度绿原酸入药，一次用药量相当于高纯度绿原酸1毫克左右，制备成的制剂，一方面不能充分发挥绿原酸的药理药效，另一方面它们无效成分多，质量指标的制定和检验都困难。因此本发明和现有这些中成药相比，一方面能充分发挥绿原酸的药理药效，另一方面绿原酸的纯度和含量高，质量指标的制定和检验容易操作。一种绿原酸提取分离的方法本发明公开了一种绿原酸提取分离的方法，特别是从杜仲树叶、元宝枫树叶中提取、分离、纯化绿原

58、酸的方法，包括溶剂浸出、树脂吸附、萃取、干燥、结晶等步骤。本发明与现有技术比较，具有工艺简单、生产成本低、产品质量好、效益高等优势，产品纯度95以上，本发明已通过工业化试验。从金银花中提取制备绿原酸的工艺从金银花中提取制备绿原酸的工艺，属于医药化工领域，主要解决绿原酸精品提取问题。其步骤是：金银花加水或乙醇进行回流提取，过滤，收集滤液并回收溶剂，加乙醇沉淀杂质，过夜，过滤，减压回收溶剂，加水适量，静置过夜，过滤，滤液上大孔树脂柱，用洗脱剂浓缩，收集含有绿原酸的组分，上聚酰胺柱，用洗脱剂洗脱，收集含有绿原酸的组分，浓缩，精制得到含量大于95的绿原酸。本方法可以工业化地从金银花中获得含量大于95的绿原酸单体，而且提取成本并不明显提高。这